邵錦根，李旭升，陶紅苗，何忠平，劉曉玲，周向平

(1.金華市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 金華 321000；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 金華 321000；3.金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，浙江 金華 321000；4. 金華市人民醫(yī)院 康復(fù)科，浙江 金華 321000)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH )具有發(fā)病率、死亡率、致殘率和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。臨床流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示[2-3]，我國腦出血發(fā)病率占腦卒中的19.2%～53.5%。腦出血的發(fā)生機(jī)制可能與多種原因?qū)е碌纳窠?jīng)元受損、神經(jīng)功能缺失有關(guān)[4]。自體干細(xì)胞可在微創(chuàng)移植針的輔助下移植至腦組織壞死區(qū)，為腦出血的臨床治療提供了新思路[5]。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)己被證實(shí)可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并能在受損的腦和脊髓中存活、增殖，使受損的神經(jīng)功能得到改善[6]。研究表明[7-9]，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)可提高培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，并對腦出血的神經(jīng)元變性、壞死具有保護(hù)和修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)[10]，間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染NGF基因后，出現(xiàn)神經(jīng)元樣的形態(tài)變化及相關(guān)蛋白表達(dá)，提示在一定環(huán)境下NGF可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。本研究觀察過表達(dá)NGF的UCMSCs在大鼠腦出血中的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 80只SPF級SD雄性大鼠于相同環(huán)境中飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組：空白對照組20只，腦出血組20只，NGF治療組20只，GFP空載對照組20只。腦出血組、NGF治療組和GFP空載對照組按Rosenberg等[11]的方法制備大鼠腦出血模型。空白對照組不接受任何處理，正常飲食；腦出血組建模后正常飲食；NGF治療組推注移植NGF-UCMSCs細(xì)胞懸液至腦出血模型大鼠左側(cè)腦室，推注后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)；GFP空載對照組推注GFP空載對照UCMSCs細(xì)胞懸液至腦出血模型大鼠左側(cè)腦室，推注后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑購自Thermo Fisher公司，Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒購自Sigma-aldrich公司，PowerUp SYBR Green試劑盒購自Thermo Fisher公司，ECL試劑盒購自Biovision公司，PVDF膜購自Millipore公司，HRP-羊抗兔IgG、兔抗人NGF多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體購自Abcam公司。Bio-Rad CFX96 PCR System熒光定量PCR儀購自Bio-Rad 公司，GE Image scanner III凝膠電泳圖像掃描分析儀購自GE 公司，化學(xué)發(fā)光分析儀購自Thermo 公司。

1.3 大鼠腦出血模型制備 參考Rosenberg等[11]的方法，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定尾狀核的位置，選擇前囟0.1 mm，矢狀縫向右3.0 mm，深5.5 mm為注射點(diǎn)。按0.1 mL/100g劑量，以0.3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上。常規(guī)消毒頭皮正中，切開皮膚，暴露前囟。以骨鉆鉆孔后，注射Ⅳ型膠原酶2 μL，注射時(shí)間5 min以上，留針10 min后緩慢退針。以骨蠟封閉鉆孔，局部以碘伏消毒，縫合皮膚。模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)[12]：采用Bederson評分標(biāo)準(zhǔn)，0分：未見神經(jīng)功能缺損；1分：前肢出現(xiàn)任何屈曲成分，不伴其他異常；2分：側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽性，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為；3分：同2分行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)(提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性)。模型制備后6 h，選擇評分2分及以上的大鼠作為制備成功模型，排除術(shù)后昏迷或死亡大鼠。

1.4 NGF過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建 通過Pubmed檢索Human NGF mRNA序列，以pLVX.CMV.eGFP.PGK.PruoR載體，元件順序?yàn)?FLAG-NGF-GFP，將NGF構(gòu)建至pLVX.CMV.eGFP.PGK/PuroR載體上形成3FLAG-NGF-GFP病毒顆粒[13]。

1.5 UCMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 取大鼠的臍帶組織，PBS清洗并剪碎后采用組織分離器攪拌3次，300 g離心15 min，棄上清。PBS洗滌3次，加DMEN/F12培養(yǎng)液，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。收集第3代細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá)，CD34、CD45陰性，CD14陰性，CD73陽性，CD19陰性，CD105陽性，CD90陽性為大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染 鑒定后的細(xì)胞傳代擴(kuò)增，5.0×105/mL的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，加入MOI值為10的病毒液+8 ng/mL Polybrene，轉(zhuǎn)染組攜帶NGF，對照組僅攜帶GFP，培養(yǎng)6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞備用。

1.7 熒光定量PCR 以Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄cDNA 2 μL為模板，10 μmol/L引物1 μL，2×SYBR Green Master Mix，ddH2O 7 μL，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，比較2-△△Ct值。

1.8 蛋白免疫印跡 1.0×106個(gè)細(xì)胞加400 μL混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液，冰上裂解30 min后，4℃ 12 000 g 離心5 min，取上清。以BCA法蛋白定量后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%BSA封閉PVDF膜2 h，洗滌后滴加兔抗NGF溶液(1∶1 000)，4℃過夜孵育。TBST洗滌去除多余一抗后，與HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。TBST清洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，顯影拍照。以Quantity One軟件對蛋白條帶光密度進(jìn)行檢測，NGF與β-actin條帶光密度比值為NGF相對表達(dá)量。

1.9 細(xì)胞移植 大鼠造模成功后6 h，NGF治療組在無菌條件下，以1 μL/min的速度緩慢推注2 μL NGF-UCMSCs細(xì)胞懸液至大鼠左側(cè)腦室；GFP空載對照組推注GFP空載對照細(xì)胞懸液，推注后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)動物。

1.10 Brdu免疫熒光檢測 大鼠斷頭取腦后以多聚甲醛固定腦組織。腦組織經(jīng)梯度蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片。采用漂片法進(jìn)行免疫熒光染色，取各組相同編號的厚10 μm的腦片置于4%多聚甲醛的24孔板中固定30 min，含0.3% Triton X-100的PBS洗滌3次。依次放入4℃ 2 mol/L HCl中10 min，室溫2 mol/L HCl中10 min，37℃ 2 mol/L HCl中20 min裂解DNA?？乖迯?fù)后，以PBS洗滌3次。加山羊血清封閉1 h。Brdu標(biāo)記腦出血的NGF-UCMSCs 細(xì)胞。再孵育小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體，4℃過夜。次日以PBS洗滌3次，常溫下避光孵育山羊抗小鼠-488抗體2 h。避光下，PBS洗滌3次，貼片后避光晾干，防熒光淬滅劑封片，暗室下熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.11 觀察指標(biāo) ①采用改良神經(jīng)功能損傷評分(modified neurological severity score, mNSS)[14]評估神經(jīng)行為情況，包括平衡木實(shí)驗(yàn)、行走測試、反常運(yùn)動、感覺測試、反射缺失、提尾反射等。0分為無受損，1～6分為輕型受損，7～12分為中型受損，13～18分為重型受損。②出血灶周圍腦組織水含量：以10%水合氯醛注入大鼠腹腔內(nèi)行局部麻醉，剪心臟放血法處死后，斷頭取出血灶周圍腦組織；采用干濕比重法測定出血灶周圍腦組織水含量。③血腫體積：采用圖像分析管理系統(tǒng)計(jì)算血腫體積，血腫體積=切面出血面積總和×切面厚度。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后UCMSCs細(xì)胞的NGF表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染后UCMSc細(xì)胞NGF mRNA和蛋白水平均高于GFP對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A: 熒光定量PCR; B：蛋白免疫印跡；**P<0.01。圖1 轉(zhuǎn)染后UCMSCs細(xì)胞的NGF表達(dá)情況

2.2 大鼠腦組織細(xì)胞移植情況 NGF治療組移植后，熒光顯微鏡下大鼠腦組織出血灶周圍可見綠色熒光，見圖2。

A: NGF治療組移植后1 d；B：NGF治療組移植后3 d；C：NGF治療組移植后7 d；D：NGF治療組移植后14 d；E: GFP空載對照組移植后1 d; F: GFP空載對照組移植后3 d; G: GFP空載對照組移植后7 d; H: GFP空載對照組移植后14 d。圖2 大鼠腦組織出血灶周圍Brdu免疫熒光圖(×200)

2.3 大鼠神經(jīng)功能評分 NGF治療組移植后1 d、3 d、7 d、14 d mNSS評分均低于腦出血組、GFP空載對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 細(xì)胞移植后大鼠改良神經(jīng)功能損傷(mNSS)評分分)

注：與NGF治療組比較，*P<0.05。

2.4 出血灶周圍腦組織水含量 與空白對照組相比，移植后第2周腦出血組、NGF治療組和GFP空載對照組出血灶周圍腦組織水含量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對照組相比，移植后第4周各組大鼠出血灶周圍腦組織水含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與腦出血組比較，NGF治療組移植后第1周和第2周的腦組織含水量均低于腦出血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠出血灶周圍腦組織水含量

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與腦出血組比較，#P<0.05。

2.5 出血灶周圍腦組織血腫體積 與空白對照組相比，移植后第1周、第2周和第4周腦出血組、NGF治療組和GFP空載對照組出血灶周圍腦組織血腫體積均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與腦出血組比較，NGF治療組移植后第1周、第2周和第4周的腦組織血腫體積均低于腦出血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠出血灶周圍腦組織血腫體積

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與腦出血組比較，#P<0.05。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于中胚層的非造血干細(xì)胞，在一定條件及微環(huán)境下，可跨胚層分化為多種細(xì)胞，使不可再生細(xì)胞的再生成為可能。研究表明[14]，臍帶血中也含豐富的MSCs，可向3個(gè)胚層來源的細(xì)胞分化。同時(shí)，UCMSCs具有來源豐富、取材方便，增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)可提高神經(jīng)元的培養(yǎng)存活率，對腦出血的神經(jīng)元變性、壞死具有保護(hù)和修復(fù)作用[15]。

有研究發(fā)現(xiàn)[16]，轉(zhuǎn)染NGF基因后的間充質(zhì)干細(xì)胞會出現(xiàn)神經(jīng)元樣的形態(tài)變化及相關(guān)蛋白表達(dá)，提示NGF可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化。多項(xiàng)研究證實(shí)[17-18]，MSCs移植后可在體內(nèi)存活并聚集于損傷區(qū)域周圍，分化表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物，促進(jìn)宿主神經(jīng)細(xì)胞的存活和再生。Mu等[19]采用BDNF腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs，移植入大鼠大腦動脈7～14 d后，其神經(jīng)功能恢復(fù)效果和梗死范圍均優(yōu)于未移植MSCs的對照組。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染UCMSCs細(xì)胞過表達(dá)NGF基因，以熒光定量PCR及蛋白免疫印跡觀察轉(zhuǎn)染效率。將NGF過表達(dá)的UCMSCs移植入大鼠腦出血區(qū)域周圍，結(jié)果顯示，NGF治療組移植后1 d、3 d、7 d、14 d mNSS評分均明顯低于腦出血組、GFP空載對照組，提示可能原因：①移植細(xì)胞及分化的神經(jīng)樣細(xì)胞可發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)連接作用，與神經(jīng)細(xì)胞建立傳入、傳出聯(lián)系。②移植細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素、集落刺激因子、干細(xì)胞因子等，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞代謝，減輕細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軸突再生及神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，啟動內(nèi)源性修復(fù)，促進(jìn)微血管形成，改善神經(jīng)功能[20-21]。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，與腦出血組比較，NGF治療組移植后第1周和第2周的腦組織含水量和血腫體積均明顯低于腦出血組。以Brdu熒光單標(biāo)觀察NGF過表達(dá)的UCMSCs細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)均可見綠色熒光標(biāo)記的NGF過表達(dá)的UCMSCs細(xì)胞，提示UCMSCs可遷移至腦出血灶周圍存活，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減少血腫量。

綜上所述，NGF過表達(dá)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠腦出血可改善大鼠神經(jīng)功能，減少腦組織含水量及血腫體積。