吳玲梅，顧杰，溫智清，賈鵬*，劉瑞婷，蔣潔蘭，劉葒，鄭曉聰，毛明光*

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518045)

Hepcidin是一種主要由肝臟產(chǎn)生的分泌肽激素，是鐵攝入和全身鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，屬于富含半胱氨酸且具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的抗菌肽超家族[1-2]。它首先在人體血液和尿液中被鑒定為先天性免疫抗菌肽，后來發(fā)現(xiàn)其主要由肝臟分泌，又稱之為肝臟表達(dá)的抗菌多肽[1,3]。Hepcidin在體內(nèi)或體外具有抑制細(xì)菌、真菌、原生動物生長和抑制腫瘤的作用[4]，可作為機(jī)體抵御病原入侵的第一道防線。目前，對魚類抗菌肽的研究較廣泛，主要涉及免疫、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等[5]。已從大西洋鱈Gadusmorhua、大菱鲆Scophthalmusmaximus、虹鱒Oncorhynchusmykiss等魚中克隆到抗菌肽[6]。根據(jù)功能和來源，抗菌肽又可分為Hepcidin、Cathelicidins、Chrysophsins、LEAP-2、Pleurocidin等幾種類型。研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的斑點叉尾鮰IetaluruspunetausHepcidin蛋白對大腸桿菌E.coli、銅綠假單胞菌P.aeruginosa的生長有抑制作用[7]。重組表達(dá)的鯉CyprinuscarpioHepcidin蛋白對大腸桿菌E.coli有抑制作用，而對金黃色葡萄球菌S.aureus未表現(xiàn)出抑制作用[8]。人工合成的海水青鳉Oryziasmelastigmus抗菌肽OmHep1和pro-OmHep1可抑制紅螯螯蝦Cheraxquadricarinatus體內(nèi)白斑綜合征病毒(WSSV)的復(fù)制[9]。莫桑比克羅非魚Oreochromismossambicus抗菌肽TH2-3的成熟肽能明顯抑制人纖維肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。由此可見，抗菌肽不僅對細(xì)菌類病原有抑制作用，而且在抗病毒和抗腫瘤中也發(fā)揮著重要作用。

太平洋鱈Gadusmacrocephalus又稱大頭鱈，是鱈科重要的海洋經(jīng)濟(jì)種類，該魚在中國黃渤海的資源日益減少，而人工繁育又面臨神經(jīng)壞死病毒的困擾[11-13]，為此，本研究中擬在前期轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)上克隆太平洋鱈抗菌肽Hepcidin(GmHep)的基因序列，并揭示其在太平洋鱈不同組織和發(fā)育早期的表達(dá)模式，利用基因工程手段構(gòu)建GmHep的原核表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件，獲得表達(dá)產(chǎn)物，旨在為開發(fā)太平洋鱈抗菌肽奠定基礎(chǔ)，為解決太平洋鱈人工繁育提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用太平洋鱈成魚采自大連市旅順口區(qū)附近海域，平均體質(zhì)量為2.438 kg，均已性成熟，取發(fā)育較好的成魚進(jìn)行人工授精，受精卵孵化后第5、10、30、37、40 d時分別取5尾仔魚；另取3尾成魚的肝、腎、脾、腦、腸、鰓、肌肉組織用于組織差異表達(dá)分析。各樣品用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 總RNA提取方法參照Tripure Reagent(羅氏)說明書進(jìn)行，采用NV 3000 微量分光光度計檢測RNA濃度，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量和完整性。經(jīng)DNaseⅠ處理500 ng總RNA去除基因組DNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃下保存。

1.2.2GmHep基因克隆及測序 根據(jù)本實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的太平洋鱈GmHep基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計合成引物(GmHep-F1:5′ATGAAGGCATTCAGCATTGCAGTTG 3′;GmHep-R1:5′AACGTGAGGGACTAGAATTTGC 3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以太平洋鱈肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增獲得GmHep基因片段序列?；厥誔CR產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa)連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 基因序列生物信息學(xué)分析 利用軟件DNAMan對基因序列和氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測分析；利用軟件BioEdit和MEGA 5.0對Hepcidin氨基酸序列進(jìn)行同源比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同源序列由BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數(shù)據(jù)庫檢索獲得。利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對GmHep氨基酸序列進(jìn)行信號肽結(jié)構(gòu)預(yù)測；用ExPASy(https://www.expasy.org/)在線分析工具進(jìn)行蛋白分子量和等電點的分析預(yù)測。

1.2.4GmHep組織分布及發(fā)育早期表達(dá)模式 根據(jù)太平洋鱈GmHep和內(nèi)參基因β-actin序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量引物(GmHep-qF: 5′ TGGCAGGATACTGGATGA 3′，GmHep-qR: 5′AAATGCCACAGCCCTTCT 3′；β-actqF: 5′ATCCGTAAGACCTGTATGC 3′，β-actqR: 5′AGTATTTACGCTCAGGTGGG 3′)，分別以各個組織cDNA和不同日齡幼魚cDNA為模板，進(jìn)行Real-time PCR(qPCR)反應(yīng)。組織差異表達(dá)以鰓組織作為對照組進(jìn)行相對定量分析，不同發(fā)育時期的樣品以5日齡樣品為對照組進(jìn)行相對定量分析，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件分析，以0.05為顯著性水平。

1.2.5GmHep原核載體構(gòu)建及表達(dá)條件優(yōu)化 設(shè)計含有EcoRI和XhoI酶切位點的引物(GmHep-exp-F1: 5′ CGGAATTCATGGCCACCGTCCGCTGGG- CGGGCAG 3′；GmHep-exp-R1: 5′CCGCTCGAGCTAGAATTTGCAGCAAATG 3′，下劃線為酶切位點序列)，以GmHep基因為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，利用EcoRI和XhoI酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，同時也對原核表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切，使用T4DNA連接酶對兩個酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21 (DE3)中。原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化參照文獻(xiàn)[14-15]。

1.2.6 GmHep亞細(xì)胞定位 根據(jù)GmHep的開放閱讀框(ORF)序列和pEGFP-N1表達(dá)載體酶切位點序列設(shè)計特異引物(GmHep-exp-F2:5′ ATCAAGCTTATGGCCACCGTGCCGCTGGGC 3′；GmHep-exp-R2:5′ACCGTCGACTGGAATTTGCAGCAAATGCCACA 3′)，將質(zhì)粒pEGFP-N1和含有GmHep基因的pMD18-T質(zhì)粒分別用HindⅢ與SalI雙酶切(下劃線為酶切位點序列)，回收線性化pEGFP-N1質(zhì)粒和GmHep基因，連接轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆并測序,命名為pEGFP-GmHep。根據(jù)FuGENE?6 Transfection Reagent(Promega)試劑說明，將鯉上皮瘤細(xì)胞(EPC)平鋪于6孔板，20 h后將0.5 ngpEGFP-GmHep轉(zhuǎn)染EPC，轉(zhuǎn)染48 h后開始染色。用Hoechst標(biāo)記細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)并拍照[16]。

2 結(jié)果

2.1 GmHep基因序列分析

GmHep基因長度為1045 bp，ORF長度為297 bp，C-端非編碼區(qū)有兩個“AATAA”終止信號序列，編碼98個氨基酸(圖1)。信號肽切割位點位于第22和23個氨基酸之間，GmHep成熟肽由76個氨基酸組成，C-端具有典型的8個半胱氨酸殘基特征，預(yù)測成熟肽分子量為8555，理論pI 6.91。

利用DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，GmHep氨基酸序列N-端信號肽和C-端半胱氨酸活性區(qū)域較為保守，其他區(qū)域保守性較差。GmHep與大西洋鱈Hepcidin的一致性可達(dá)93%，與其他多數(shù)魚類的一致性為50%～60%，由此可見，鱈的抗菌肽具有特殊性。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，鱈屬魚類抗菌肽單獨成支，其他大部分魚類聚為一大支(半滑舌鰨除外)，兩棲類和哺乳類分別聚為一支(圖2)，這表明GmHep與其他物種存在明顯差異。

2.2 GmHep mRNA的組織分布

利用qPCR技術(shù)檢測GmHepmRNA在太平洋鱈各組織中的分布[13]，結(jié)果顯示，在肝、頭腎、脾、腦、腸、鰓、肌肉中均檢測到GmHep表達(dá)，其中在肝臟中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，其次是脾和腸，GmHep在肝臟中的表達(dá)量約為脾的1.59倍，腸的5.79倍(圖3-A)。太平洋鱈發(fā)育早期GmHep的相對表達(dá)量處于較低水平，但在10日齡時GmHep的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他日齡(P<0.05)(圖3-B)，原因可能是在該時期受到外界環(huán)境刺激引起的。

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

如圖4-A所示，除了對照組，各IPTG濃度下目的蛋白均大量表達(dá)，由于IPTG具有一定毒性，宜選擇最低誘導(dǎo)濃度，因此，誘導(dǎo)劑IPTG的最佳添加濃度為 0.01 mmol/L。如圖4-B 所示，在22～30 ℃時，目的蛋白的表達(dá)量隨溫度的升高而增多，表達(dá)量最高值出現(xiàn)在30 ℃，37 ℃時表達(dá)量降低，因此，最適誘導(dǎo)溫度為 30 ℃。如圖4-C所示，目的蛋白在誘導(dǎo) 2 h 后開始表達(dá)，且在 2～4 h 時表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的延長而增多，4 h 后表達(dá)量趨于穩(wěn)定，因此，最佳誘導(dǎo)時間為4 h。

2.4 GmHep的亞細(xì)胞定位

轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)Hoechst染色后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到藍(lán)色細(xì)胞核，目的蛋白與綠色熒光蛋白共表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中(圖5)，表明GmHep蛋白主要定位細(xì)胞質(zhì)中。

3 討論

3.1 GmHep結(jié)構(gòu)的保守性與特異性

本研究中推導(dǎo)的GmHep氨基酸序列由98個氨基酸組成，Hepcidin N端信號肽序列和C端半胱氨酸區(qū)域相對保守，C端具有8個半胱氨酸，可形成4個二硫鍵結(jié)構(gòu)，這與文獻(xiàn)報道的Hepcidin典型結(jié)構(gòu)特點[17]是一致的。然而，除了N端和C端區(qū)域，其他區(qū)域同源性并不高。太平洋鱈Hepcidin與大西洋鱈Hepcidin一致性可達(dá)93%，但與其他魚類一致性卻達(dá)不到60%，說明鱈Hepcidin具有自身獨特的結(jié)構(gòu)特點。目前，在太平洋鱈和大西洋鱈中僅發(fā)現(xiàn)了一種Hepcidin，在其他魚類中發(fā)現(xiàn)了多種類型，如Huang等[18]從尼羅羅非魚肝臟中分離出了3種Hepcidin，分別為TH1-5、TH2-2和TH2-3；Yang等[19]在黑鯛中發(fā)現(xiàn)了7個Hepcidin突變體，其中AS-hep2在肝臟中特異高表達(dá)，而AS-hep6在頭腎中特異高表達(dá)，這與之前所有Hepcidin均在肝臟中高表達(dá)的情況不同。

3.2 GmHep在太平洋鱈中的表達(dá)模式與功能探討

在小鼠和人類中，Hepcidin主要由肝臟表達(dá)，但肝外表達(dá)也被證實，盡管數(shù)量較少[20]。對犬Hepcidin的研究發(fā)現(xiàn)，Hepcidin在肝臟中特異表達(dá)，在腎臟、肺和骨髓中mRNA含量很少，其他組織幾乎檢測不到[21]。哺乳動物Hepcidin是機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)控因子，Nicolas等[22]對使用Upstream Stimulatory Factor(USF)上游刺激因子敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，這種小鼠肝臟存在嚴(yán)重的鐵沉積，原因是敲除USF以后下游的Hepcidin基因也不能表達(dá)，導(dǎo)致Hepcidin缺乏的組織鐵積聚，而Hepcidin基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的鐵缺乏和嚴(yán)重的細(xì)胞性貧血且生存時間大大縮短。

Hepcidin的結(jié)構(gòu)在魚類和哺乳類之間存在高度保守性。Lauth等[23]使用核磁共振方法獲得了白鱸Hepcidin的蛋白結(jié)構(gòu)，表明白鱸Hepcidin蛋白與人類Hepcidin蛋白具有非常相似的結(jié)構(gòu)，但二者的表達(dá)模式卻有顯著的不同。2008年，對大西洋鱈的研究發(fā)現(xiàn)，Hepcidin主要由肝臟表達(dá)，在腎臟和脾臟中也有較高表達(dá)，但在其他組織中表達(dá)量較低[24]。本研究結(jié)果顯示，GmHep主要在肝臟中表達(dá)，這與對大西洋鱈研究結(jié)果基本一致。大西洋鱈在鰻利斯頓氏菌Listonellaanguillarum的感染下，各組織中的Hepcidin均出現(xiàn)顯著升高，說明鱈的Hepcidin對細(xì)菌感染有著較明顯的活性。然而，本研究中對太平洋鱈發(fā)育早期的檢測發(fā)現(xiàn)，在不同時期均檢測到了GmHep的表達(dá)，雖然表達(dá)水平較低，但在孵化后第10天時其表達(dá)量顯著上升，這可能是受到外界刺激或者細(xì)菌感染所致，說明GmHep在發(fā)育早期也可以出現(xiàn)較高水平的表達(dá)，以發(fā)揮非特異免疫防御的功能。

3.3 GmHep的體外表達(dá)研究與展望

從進(jìn)化樹和序列比對發(fā)現(xiàn)，GmHep既有較高的結(jié)構(gòu)保守性，又有序列特異性，可推測其功能與其他魚類存在差異。為此本研究中根據(jù)已知序列設(shè)計特異引物，構(gòu)建了GmHep成熟肽的原核表達(dá)載體，并優(yōu)化表達(dá)條件，成熟肽分子量約為8555，表達(dá)載體含有標(biāo)簽序列6×His、Trx等，載體與目的基因共表達(dá)的產(chǎn)物分子量約為35 000左右，這與SDS-PAGE結(jié)果基本一致。原核表達(dá)具有表達(dá)效率高的優(yōu)點，但原核表達(dá)的蛋白在空間結(jié)構(gòu)上會出現(xiàn)錯誤折疊，進(jìn)而影響其功能，后期可通過變性再復(fù)性的手段提高其活性。另外，有研究顯示，原核表達(dá)菌也是一種細(xì)菌，Hepcidin可以抑制表達(dá)菌的擴(kuò)增，進(jìn)而影響表達(dá)效果。Peng等[25]從水生動物中克隆獲得了多種抗菌肽，并利用酵母表達(dá)技術(shù)進(jìn)行體外表達(dá)，避免了原核表達(dá)的缺點，并獲得了較好的產(chǎn)品。本研究中未發(fā)現(xiàn)重組蛋白對表達(dá)菌有抑制的作用，這可能是原核表達(dá)的GmHep在空間結(jié)構(gòu)上存在不確定性，仍需構(gòu)建真核表達(dá)載體進(jìn)一步深入探討。

近幾年，由于抗生素的不當(dāng)使用，造成了耐藥菌株的出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)了超級細(xì)菌，危害極大。而抗菌肽來源于動物自身，新型抗菌肽的研發(fā)與應(yīng)用越來越被業(yè)界重視，本研究中利用原核表達(dá)技術(shù)探討了太平洋鱈Hepcidin體外表達(dá)的特點，為將來開展酵母表達(dá)和開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。