梁簫，童歡，彭莉華,楊麗婷，常睿珩，楊金龍*

(1.上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306)

大多數(shù)海洋無脊椎動物可以識別環(huán)境信號來調(diào)節(jié)自身的附著變態(tài)過程。研究證明，海洋細菌可通過形成生物被膜，參與調(diào)控大多數(shù)海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)[3]。例如，Pseudoalteromonas是變形菌門的一類革蘭氏陰性海洋細菌屬，可分泌多種具有生物學(xué)活性的胞外產(chǎn)物[4-5]，其生物被膜能促進華美盤管蟲Hydroideselegans[6]和厚殼貽貝[7]等幼蟲的附著變態(tài)。而Shewanella是變形菌門γ-變形菌綱的兼性厭氧革蘭氏陰性細菌，具有較強的成膜能力和多產(chǎn)的胞外產(chǎn)物，對厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)具有高誘導(dǎo)活性[7]。

纖維素在自然界中分布廣泛，多種細菌可以產(chǎn)生纖維素，且大多數(shù)細菌生物被膜胞外產(chǎn)物中包含纖維素，纖維素可參與生物被膜的形成，具有重要的生物學(xué)功能[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，纖維素的過量產(chǎn)生能有效提高假交替單胞菌屬細菌生物被膜的抗污損性能，抑制厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[10]，但纖維素對細菌生物被膜的形成產(chǎn)生何種影響及對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的調(diào)控機制尚不清楚。本研究中，選取了對厚殼貽貝附著具有誘導(dǎo)活性的假交替單胞菌屬和希瓦氏細菌屬[7,11]為研究對象，探討了纖維素與海洋細菌形成生物被膜過程前后對生物被膜的細菌密度與分布、膜厚和胞外產(chǎn)物等生物學(xué)特性的影響，以及這些變化對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響，旨在為貝類與海洋細菌互作關(guān)系及貝類附著分子機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的眼點期厚殼貽貝幼蟲，均于2017年5月取自浙江省舟山市嵊泗縣(30°69′N、122°46′E)，在鹽度為30的自然海水中于18 ℃黑暗條件下充氣培養(yǎng)，密度為104cells/L，每隔2 d換水一次，每日一次投喂湛江等鞭金藻餌料(1×104cells/mL)。所有幼蟲均適應(yīng)一周后進行試驗。取纖維素[默克生命科學(xué)(上海)有限公司]1 g溶于500 mL 滅菌過濾海水(Autoclaved filtered seawater，AFSW)中制成母液，調(diào)pH為7.6。試驗用海洋細菌Pseudoalteromonasatlantica、Shewanellaloihica均分離于自然生物被膜，于-80 ℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜制備 參照楊金龍等[12]的方法，取-80 ℃下保存的P.atlantica、S.loihica菌劃線于ZoBell 2216E平板上，于25 ℃下培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種到80 mL液體培養(yǎng)基，黑暗條件下25 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，以3500 r/min離心15 min，去培養(yǎng)液，用AFSW清洗3次，最后加入AFSW定容至50 mL，均勻混合至細菌懸浮液，取10 μL稀釋100倍后，取1 mL菌液用0.22 μm濾膜(Whatman)過濾，用0.1%吖啶橙染色5 min，在熒光顯微鏡(Olympus BX51)×1000放大倍率下選擇10個隨機視野計數(shù)，計算細菌總密度。

1.2.2P.atlantica、S.loihica與纖維素共同形成生物被膜 取無菌載玻片放入高溫滅菌培養(yǎng)皿(直徑為64 mm × 19 mm)中，加入適量細菌懸浮液和纖維素，隨后加入適量AFSW定容至20 mL，細菌終濃度為1.0×108cells/mL，纖維素終濃度為0(對照)、0.02、0.2、2、20、200 mg/L，每個濃度設(shè)置9個平行，18 ℃下避光培養(yǎng)48 h形成生物被膜。

1.2.3 纖維素處理 當P.atlantica、S.loihica單一生物被膜形成后，取出載玻片，用AFSW清洗后放入無菌培養(yǎng)皿中，加入纖維素，隨后加入適量AFSW定容至20 mL，使纖維素終濃度為0(對照)、0.02、0.2、2、20、200 mg/L，每個濃度設(shè)置9個平行，18 ℃下避光培養(yǎng)。

現(xiàn)階段，網(wǎng)絡(luò)攻擊信息的形式，逐漸呈現(xiàn)出多樣化的發(fā)展趨勢。在開放、虛擬的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境當中，存在著大量的不良信息，其中包括很多的垃圾郵件，這些垃圾郵件當中，有很多已經(jīng)被黑客植入了病毒，用戶一旦點擊查看的話，就會感染病毒，導(dǎo)致系統(tǒng)出現(xiàn)癱瘓，影響到正常使用。[2]

1.2.4 幼蟲附著試驗 將附有生物被膜的載玻片清洗，緩慢放入到20 mL AFSW的無菌培養(yǎng)皿中，隨后各加入20只眼點幼蟲，18 ℃下避光培養(yǎng)。記錄12、24、48、96 h時幼蟲附著變態(tài)個體數(shù)，計算幼蟲附著變態(tài)率。

1.2.5 生物被膜細菌密度計數(shù) 參照楊金龍等[12]方法，生物被膜用5%福爾馬林溶液固定24 h，用0.1%吖啶橙染色5 min，在熒光顯微鏡(Olympus BX51)×1000放大倍率下隨機選取10個視野計數(shù)，每組3個平行，計算生物被膜細菌的密度。

1.2.6 生物被膜掃描電鏡試驗 將單一細菌生物被膜及2 mg/L纖維素處理的生物被膜浸泡于5%甲醛溶液中固定24 h，用1×PBS溶液清洗以去除殘余甲醛溶液，在濃度為25%、50%、75%、100%的乙醇溶液中梯度脫水，每次10 min，室溫晾干，使用Hitachi S-3400N II 型掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy，SEM)，5 kV加速電壓，在×6500放大倍率下觀察，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機選取10個視野，并拍攝記錄。

1.2.7 生物被膜激光共聚焦試驗 將單一細菌生物被膜及2 mg/L纖維素處理的生物被膜浸泡于5%的甲醛溶液中固定24 h，再用5 μg/mL的碘化丙啶(PI)溶液浸染15 min，使用激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)×630放大倍率下觀察，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機選取10個視野，并拍攝記錄。

1.2.8 生物被膜胞外多糖染色試驗 將單一細菌生物被膜及2 mg/L纖維素處理的生物被膜浸泡于10%甲醛溶液中固定24 h，用1×PBS清洗，使用200 μL濃度為100 μg/mL 的Fitc-conA[默克生命科學(xué)(上海)有限公司]染色液浸染20 min，隨后使用1×PBS溶液和Tris溶液清洗以去除殘留的Fitc-conA染色液；再用200 μL濃度為10 μmol/L的STYO64染色液避光侵染2 min，用1×PBS溶液和Tris溶液清洗3次以去除殘留的STYO64染色液，室溫下避光晾干。每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機選取10個視野，并拍攝記錄。

1.2.9 生物被膜胞外脂類染色試驗 將單一細菌生物被膜及2 mg/L纖維素處理的生物被膜浸泡于10%甲醛溶液中固定24 h，用1×PBS清洗，使用蘇丹紅染色液避光染色20 min，隨后將生物被膜輕放入1×PBS溶液中，避光浸洗5 min，室溫晾干。每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機選取10個視野，并拍攝記錄。

1.2.10 生物被膜胞外蛋白染色試驗 將單一細菌生物被膜及2 mg/L纖維素處理的生物被膜浸泡于10%甲醛溶液中固定24 h，用1×PBS清洗，使用考馬斯亮藍染色液避光染色1 h，在脫色液中避光脫色10 min，隨后將生物被膜輕放入1×PBS中，避光浸洗10 min，室溫晾干。每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機選取10個視野，并拍攝記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用JMP 10.0.0軟件進行統(tǒng)計分析及相關(guān)性檢驗。將原始數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)化及正態(tài)性檢驗，若滿足正態(tài)分布且方差相同，則使用單因素方差分析，若不滿足正態(tài)性分布，則使用Tukey-Kramer法進行顯著性檢驗。之后使用Steel-Dwass和Wicoxon法進行評估檢驗。使用IBM SPSS Statistics 20軟件偏相關(guān)分析方法，對影響生物被膜誘導(dǎo)活性的纖維素濃度和細菌密度進行相關(guān)性檢驗，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

從圖1可見：在無細菌形成生物被膜情況下，5個濃度組的纖維素懸浮液對幼蟲的附著變態(tài)與空白對照組并無顯著性影響(P>0.05)。

2.2 纖維素與P.atlantica和S.loihica共同形成的生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

從圖2可見：纖維素與P.atlantica和S.loihica共同形成的生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率與單一細菌生物被膜相比顯著降低(P<0.05)；兩株細菌在初始細菌濃度為1×108cells/mL，纖維素濃度為2、20、200 mg/L時與2種細菌形成的生物被膜，對幼蟲附著變態(tài)的抑制最為顯著(P<0.05)；纖維素濃度為2 mg/L與P.atlantica共同形成生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率最低，為(25.0±1.4)%，顯著低于P.atlantica單一生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率(38.8±3.09)%(P<0.05)；纖維素濃度為2 mg/L與S.loihica共同形成生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率也最低，為(26.7±1.7)%，同樣顯著低于S.loihica單一生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲附著變態(tài)率(52.8±2.9)%(P<0.05)。

從圖3可見：P.atlantica和S.loihica在初始細菌濃度為1×108cells/mL時，與纖維素共同形成的生物被膜細菌密度與單一細菌生物被膜密度相比也顯著降低(P<0.05)；P.atlantica在纖維素濃度為2 mg/L時表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，在20、200 mg/L時，生物被膜細菌密度達到最低；S.loihica在纖維素濃度為0.02 mg/L時表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，并在2、20、200 mg/L時，生物被膜細菌密度達到最低。

從表1可見，P.atlantica和S.loihica生物被膜的誘導(dǎo)活性與細菌密度呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，而與纖維素濃度無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表1 纖維素濃度和生物被膜細菌密度與幼蟲變態(tài)率的偏相關(guān)性分析

Tab.1 Partial correlations analyses among the cellulose concentration,bacterial density of biofilms and metamorphosis of larvae

生物被膜biofilm纖維素濃度cellulose concentration細菌密度bacterial density of biofilm相關(guān)系數(shù)rP值 P value自由度df相關(guān)系數(shù)rP值 P value自由度dfP.atlantica與纖維素共同形成生物被膜0.0560.691510.519<0.001??51S.loihica與纖維素共同形成生物被膜0.1130.420510.765<0.001??51纖維素處理的P.atlantica生物被膜0.0970.491510.427<0.001??51纖維素處理的S.loihica生物被膜0.1510.282510.760<0.001??51

注： *為顯著相關(guān)(P<0.05)；**為極顯著相關(guān)(P<0.01)，下同

Note：* means significant effect (P<0.05)；** means very significant effect(P<0.01),et sequentia

2.3 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

從圖4可見：P.atlantica、S.loihica生物被膜形成后再加入不同濃度纖維素，對厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率與單一細菌生物被膜相比顯著下降(P<0.05)；P.atlantica生物被膜處理結(jié)果顯示，添加2 mg/L纖維素時，P.atlantica生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲變態(tài)率最低，為(17.2±1.7)%，顯著低于未添加纖維素的P.atlantica生物被膜(38.8±3.09)%(P<0.05)；S.loihica生物被膜處理結(jié)果顯示，添加濃度為2、20、200 mg/L的纖維素，對幼蟲附著變態(tài)的抑制最為顯著(P<0.05)，添加2 mg/L纖維素時，S.loihica生物被膜誘導(dǎo)的幼蟲變態(tài)率降至(21.1±2.5)%。

通過生物被膜細菌密度計算與分析，發(fā)現(xiàn)初始細菌濃度為1×108cells/mL時形成的生物被膜，加入纖維素后，P.atlantica和S.loihica生物被膜中的細菌密度均有下降趨勢(圖5)。

2.4 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜細菌形態(tài)的影響

纖維素與P.atlantica和S.loihica不同方式形成或處理的生物被膜，在掃描電鏡下觀察結(jié)果如圖6所示，其中，P.atlantica的細菌形狀呈橢圓形，細菌周圍分泌有白色胞外產(chǎn)物，與單一生物被膜相比，纖維素處理的兩種生物被膜胞外產(chǎn)物含量明顯降低，細菌量減少;而S.loihica的細菌形狀呈桿狀，細菌周圍分泌有大量白色囊狀胞外產(chǎn)物，與單一生物被膜相比，纖維素處理的兩種生物被膜胞外產(chǎn)物含量同樣明顯降低，細菌聚集程度相對分散。

2.5 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜細菌分布和膜厚的影響

纖維素與P.atlantica和S.loihica以不同方式形成或處理的生物被膜細菌聚集狀態(tài)和分布如圖7所示，其中P.atlantica和S.loihica單一生物被膜細菌密度與聚集程度相對較高，出現(xiàn)大面積塊狀聚集的細菌，而P.atlantica和S.loihica與纖維素共同形成的生物被膜，以及生物被膜形成后添加纖維素處理的生物被膜，細菌密度相對減少，分布較為分散。

從圖8可見：相比P.atlantica單一生物被膜膜厚，纖維素兩種方式處理的P.atlantica生物被膜膜厚減少29%和30%，表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)；相比S.loihica單一生物被膜膜厚，纖維素兩種方式處理的S.loihica生物被膜膜厚減少39%和40%(P<0.05)；兩種纖維素處理方式處理的P.atlantica或S.loihica生物被膜間細菌聚集狀態(tài)、分布及膜厚并無顯著性差異(P>0.05)。通過分析生物被膜誘導(dǎo)活性與膜厚同樣呈現(xiàn)極顯著性相關(guān)(P<0.01，表2)。

2.6 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜胞外多糖的影響

P.atlantica和S.loihica單一生物被膜與纖維素兩種方式處理的生物被膜胞外多糖染色結(jié)果如圖9所示。從圖9可見：P.atlantica單一生物被膜細菌呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，胞外多糖分布較為均勻，且有大量胞外多糖呈塊狀分布，而纖維素兩種方式處理的生物被膜胞外多糖含量明顯減少，多呈顆粒狀分布，兩個纖維素處理組胞外多糖的含量與分布并無明顯變化；S.loihica單一生物被膜胞外多糖分布廣泛，多呈塊狀分布，含量明顯高于纖維素兩種方式處理的兩種生物被膜，纖維素與S.loihica共同形成的生物被膜和纖維素處理的S.loihica生物被膜，胞外多糖含量與分布并無明顯差異。

表2 生物被膜膜厚與幼蟲變態(tài)率相關(guān)性分析

Tab.2 Correlation analyses between biofilm thickness and metamorphosis of larvae

生物被膜biofilm膜厚biofilm thicknessrPP.atlantica與纖維素共同形成生物被膜0.686<0.003??S.loihica與纖維素共同形成生物被膜0.877<0.001??纖維素處理的P.atlantica生物被膜0.885<0.001??纖維素處理的S.loihica生物被膜0.883<0.001??

2.7 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜胞外脂類的影響

P.atlantica和S.loihica單一生物被膜與纖維素兩種方式處理的生物被膜胞外脂類染色結(jié)果如圖10所示。從圖10可見：P.atlantica單一生物被膜胞外脂類分布較為均勻，大量胞外脂類呈塊狀分布，而纖維素兩種方式處理的生物被膜胞外脂類含量明顯減少，多呈顆粒狀分布，兩個纖維素處理組間胞外脂類含量與分布并無明顯變化；S.loihica單一生物被膜胞外脂類分布廣泛，多呈塊狀分布，含量明顯高于纖維素處理的兩種生物被膜，纖維素與S.loihica共同形成的生物被膜和纖維素處理的S.loihica生物被膜，胞外脂類含量與分布也無明顯差異。

2.8 纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜胞外蛋白的影響

P.atlantica和S.loihica單一生物被膜與纖維素兩種方式處理的生物被膜胞外蛋白染色結(jié)果如圖11所示。從圖11可見：纖維素兩種方式處理的P.atlantica生物被膜與P.atlantica單一生物被膜相比，胞外蛋白分布和含量并無明顯變化；纖維素兩種方式處理的S.loihica生物被膜與S.loihica單一生物被膜相比，胞外蛋白的分布及含量也無明顯差異。

3 討論

對海洋無脊椎動物附著影響研究發(fā)現(xiàn)，影響海洋無脊椎動物幼蟲附著變態(tài)的自然誘導(dǎo)物相對較少[13]，本研究中也發(fā)現(xiàn)，纖維素對厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)無影響。生物被膜是誘導(dǎo)厚殼貽貝附著的重要影響因素[1,7,14]，且在大多數(shù)海洋無脊椎動物幼體附著變態(tài)的發(fā)育過程中都發(fā)揮著極其重要的作用[3,15]。然而，細菌胞外產(chǎn)物對生物被膜的形成及對海洋無脊椎動物幼體附著變態(tài)的影響研究相對較少。本研究中首次探討了纖維素對海洋細菌P.atlantica和S.loihica生物被膜形成前后的生物量和胞外產(chǎn)物的影響，以及對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的調(diào)控作用。

3.1 生物被膜的生物量與幼蟲附著的相互關(guān)系

細菌密度是影響海洋無脊椎動物幼蟲附著的重要因素之一。厚殼貽貝與生物被膜的相關(guān)研究證實了生物被膜細菌密度與厚殼貽貝的附著具有顯著相關(guān)性。例如，對自然微生物被膜的研究證明了厚殼貽貝幼蟲和稚貝的附著同樣受生物被膜細菌密度的影響[1,14,16-17]；對單一細菌生物被膜的研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋菌株形成的被膜密度與厚殼貽貝的附著間具有明顯關(guān)聯(lián)性[7,12,18-19]。同樣，生物被膜細菌密度對華美盤管蟲的附著變態(tài)呈顯著相關(guān)[20]。但對鹿角杯形珊瑚Pocilloporadamicornis的研究發(fā)現(xiàn)，試驗中僅有一株細菌的密度與幼蟲的附著變態(tài)呈現(xiàn)顯著相關(guān)，其他菌株細菌密度與其附著并無相關(guān)性[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，與P.atlantica和S.loihica單一生物被膜相比，纖維素對P.atlantica和S.loihica生物被膜形成前后的細菌密度、膜厚均有影響，且隨著纖維素濃度的增加，細菌密度與膜厚呈現(xiàn)顯著下降趨勢，同時厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率顯著降低。通過偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，纖維素濃度的增加并不會影響生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)，而生物被膜細菌密度和膜厚的變化與生物被膜的誘導(dǎo)活性呈極顯著相關(guān)。由此推測，細菌密度和膜厚的降低是影響厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的因素之一。

3.2 細菌胞外產(chǎn)物與幼蟲附著的相互關(guān)系

細菌分泌的胞外產(chǎn)物是生物被膜的重要組成部分，大量研究證明，生物被膜中胞外產(chǎn)物(主要包含糖、脂、蛋白)是影響海洋無脊椎動物附著的重要影響因素[15,22]。研究表明，自然生物被膜的群落結(jié)構(gòu)和胞外產(chǎn)物對合浦珠母貝幼蟲的附著具有重要的誘導(dǎo)作用[23]。海洋細菌屬Pseudomonassp.Strain S9分泌的胞外多糖對海鞘類Cionaintestinalis幼蟲的附著具有促進作用[24]；銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa產(chǎn)生的脂類抑制了鞭毛驅(qū)動的運動性，從而促進了生物被膜的形成[25]；蛋白質(zhì)復(fù)合物(SIPC)對藤壺類Balanusamphitrite幼蟲附著具有誘導(dǎo)作用[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，纖維素處理的P.atlantica和S.loihica生物被膜誘導(dǎo)的厚殼貽貝附著變態(tài)活性降低，生物被膜中胞外多糖和胞外脂質(zhì)明顯減少，表明胞外多糖和胞外脂質(zhì)可能參與調(diào)控厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)過程。

以往研究證實了Pseudoalteromonaslipolytica生物被膜中纖維素的含量與其生物被膜的抗污損能力呈正相關(guān)[10]。本研究中利用P.lipolytica同屬細菌P.atlantica和不同屬細菌S.loihica，分析了其纖維素在生物被膜形成過程中及形成后對生物被膜生物學(xué)特性及對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，纖維素兩種處理方式處理的P.atlantica、S.loihica生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)誘導(dǎo)活性明顯降低。通過生物被膜激光共聚焦試驗進一步分析，P.atlantica、S.loihica單一生物被膜胞外多糖和胞外脂含量明顯高于纖維素處理的生物被膜，而蛋白含量無明顯差異，因此，推測生物被膜中的胞外多糖或胞外脂含量的減少也是導(dǎo)致厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)率降低的主要因素。

綜上所述，纖維素對海洋細菌P.atlantica和S.loihica生物被膜的細菌密度、膜厚及胞外多糖、胞外脂質(zhì)等有影響，并通過影響生物被膜抑制厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。本研究結(jié)果對進一步開展厚殼貽貝幼蟲附著分子機制及貝類與細菌互作關(guān)系研究提供了有益參考。