梁昊岳，張 森，于文穎，付偉超，董樹(shù)旭，趙軾軒，茹永新，高瀛岱

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300020）

0 引言

作為研究最多的組織干細(xì)胞類(lèi)型之一，造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）能夠自我更新并產(chǎn)生體內(nèi)的所有血液和免疫細(xì)胞。在不同遺傳背景的小鼠中，HSC 的活性似乎與壽命相關(guān)，穩(wěn)態(tài)條件下小鼠體內(nèi)造血干祖細(xì)胞分化發(fā)育和免疫調(diào)控是當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-4]。HSC 能夠在接受輻照的移植小鼠體內(nèi)自我更新并進(jìn)行多系造血重建。因此，基于流式細(xì)胞術(shù)建立的小鼠骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）技術(shù)是通常用于檢查小鼠HSC 活性的主要檢測(cè)方法，被廣泛應(yīng)用于小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞生物學(xué)研究[5-8]。

以FACS Diva 和FlowJo 為代表的流式分析軟件可幫助研究者獲得細(xì)胞群體比例、平均熒光強(qiáng)度分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等有效的實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，發(fā)揮著重要的實(shí)驗(yàn)支撐功能[9-12]。近期問(wèn)世的FlowJo 分析方法在已有功能的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)原理，提供了多種科學(xué)、直觀的降維分析方法，具有廣闊的應(yīng)用前景[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞進(jìn)行分析。同時(shí)，對(duì)應(yīng)用t-分布鄰域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding，tSNE）、統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）和流式自組織特征映射（flow selforganizing feature map，F(xiàn)lowSOM）分析所得結(jié)果與傳統(tǒng)流式分析結(jié)果進(jìn)行比較，以期為小鼠造血干祖細(xì)胞流式分析提供一種新方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6J（B6）同類(lèi)系小鼠用于小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)小鼠來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

流式細(xì)胞分析所需抗體APC-Cy7 標(biāo)記的小鼠Lineage markers 抗體、APC 標(biāo)記的小鼠c-kit 抗體、PE-Cy7 標(biāo)記的小鼠Sca-1 抗體、FITC 標(biāo)記的小鼠CD34 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠CD16/32 抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司。Cytometer Setup&Tracking beads、Rainbow beads、Accudrop beads 均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 儀器與設(shè)備

流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson and Company CantoⅡ，美國(guó)），離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）。

1.4 供體小鼠骨髓細(xì)胞的分離獲取

（1）B6-Ly5.1 小鼠脫頸處死，在醫(yī)用酒精中浸泡消毒5 min 后從兩條腿上解剖出脛骨和股骨，將其放入裝有預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的6 或10 mm 培養(yǎng)皿中。（2）使用鋒利的手術(shù)剪刀從骨骼中移除肌肉。對(duì)于每根骨頭，使用5 ml注射器和25 號(hào)針頭吸取3 ml 冰冷的磷酸鹽緩沖電解液（phosphate buffer electrolyte，PBE）。將針頭插入骨頭的一端，然后將骨髓從小孔中取出放入5 ml 流式管中。（3）徹底混合細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞通過(guò)30～70 μm 尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾器后放入新的5 ml 流式管中，以去除細(xì)胞團(tuán)塊。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或自動(dòng)計(jì)數(shù)器計(jì)算有核細(xì)胞的數(shù)量。將細(xì)胞懸浮在冰上備用。

1.5 流式細(xì)胞染色及上機(jī)檢測(cè)

用PBE 將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至每50 μl 約1×107個(gè)細(xì)胞。每50 μl 染色系統(tǒng)向細(xì)胞中加入抗體（APC-Cy7標(biāo)記的小鼠Lineage markers 抗體，APC 標(biāo)記的小鼠c-kit 抗體，PE-Cy7 標(biāo)記的小鼠Sca-1 抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的小鼠CD34 抗體，PE 標(biāo)記的小鼠CD16/32 抗體），并在冰上孵育細(xì)胞60～90 min。孵育后，用2 ml PBE 洗滌細(xì)胞2 次。通過(guò)30～70 μm 的尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在適當(dāng)體積的預(yù)冷PBE 中進(jìn)行流式檢測(cè)。為了區(qū)分死細(xì)胞，在使用樣品進(jìn)行流式檢測(cè)之前提前加入最終濃度為1 μg/ml 的DAPI（Pacific Blue 通道）。

1.6 分析方法

應(yīng)用FlowJoTMv10.6.1 流式細(xì)胞分析軟件（購(gòu)自美國(guó)BD 公司）對(duì)小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞進(jìn)行降維分析。

2 研究結(jié)果

2.1 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞分析結(jié)果

通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞結(jié)果如圖1 所示。首先使用Lineage Cocktail markers 去除成熟血液細(xì)胞，再經(jīng)c-kit+選出造血干祖細(xì)胞（hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC），結(jié)合Sca-1、CD34 和CD16/32 圈選出長(zhǎng)周期造血干細(xì)胞（long term HSC，LT-HSC，CD34-LSK CD16/32-）、短周期造血干細(xì)胞（short term HSC，ST-HSC，CD34+LSK CD16/32-）和多能祖細(xì)胞（multipotent progenitor，MPP，CD34+LSK CD16/32+）。各流式圖中細(xì)胞分群特征明顯，流式門(mén)圈選準(zhǔn)確，為后續(xù)生物信息學(xué)分析打下了基礎(chǔ)。

2.2 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞tSNE 分析

小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞tSNE 分析結(jié)果如圖2 所示，每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)單細(xì)胞，并根據(jù)熒光通道進(jìn)行著色，（a）～（f）分別表征DAPI、Lineage markers、c-kit、Sca-1、CD34 和CD16/32 的表 達(dá) 水平。tSNE 分析將多維度顯示的造血干祖細(xì)胞各群以二維形式呈現(xiàn)出來(lái)，處于相近位置的細(xì)胞具有相近的抗原表達(dá)水平和相近的細(xì)胞類(lèi)型。這種形式改變了常規(guī)流式分析中逐級(jí)圈門(mén)的方式，將各群細(xì)胞的抗原表達(dá)情況全面直觀地展示出來(lái)。由圖2 中可以看出，細(xì)胞群體中DAPI-細(xì)胞占絕大多數(shù)，表明細(xì)胞活性較好。Lineage markers 表達(dá)較低，c-kit 呈弱陽(yáng)性表達(dá)，Sca-1也呈弱陽(yáng)性表達(dá)，表明細(xì)胞群體主要為低分化的干祖細(xì)胞。CD34 表達(dá)以陽(yáng)性為主，與ST-HSC（58.3%）和MPP（12.6%）所占細(xì)胞群比例相符。CD16/32 有少量陽(yáng)性，與LT-HSC（22%）所占細(xì)胞群比例相符?？傮w來(lái)看，tSNE 分析結(jié)果很好地反映了細(xì)胞群體的流式分群和比例情況，所得結(jié)果直觀可信。

圖1 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞分析結(jié)果

圖2 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞tSNE 分析結(jié)果

2.3 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞UMAP 分析

小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞UMAP 分析結(jié)果如圖3 所示，每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)單細(xì)胞，并根據(jù)熒光通道進(jìn)行著色，（a）～（f）分別表征DAPI、Lineage mar-kers、c-kit、Sca-1、CD34 和CD16/32 的表達(dá)水平。分析結(jié)果與tSNE 結(jié)果相近。UMAP 分析結(jié)果圖中細(xì)胞分為3 個(gè)群，LTHSC（22%）單獨(dú)成群，其CD34 和CD16/32表達(dá)呈陰性，與所占細(xì)胞群比例相符。STHSC（58.3%）和MPP（12.6%）細(xì)胞群呈連續(xù)狀態(tài)，CD16/32 陰性群為ST-HSC，陽(yáng)性群為MPP，與所占細(xì)胞群比例相符。

2.4 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞FlowSOM 分析

如圖4（a）所示，UMAP 分析結(jié)果中紅色為L(zhǎng)T-HSC 細(xì)胞群，紫色為ST-HSC 細(xì)胞群，綠色為MPP 細(xì)胞群。如圖4（b）所示，細(xì)胞群體經(jīng)FlowSOM 分析分為8 組，熱圖顏色密度表示給定抗原的平均表達(dá)，經(jīng)歸一化后形成熱圖。8 組細(xì)胞中DAPI、Lineage 以陰性為主，c-kit、Sca-1 以陽(yáng)性為主，CD34 和CD16/32 陰、陽(yáng)性群體各有分布，反映了LT-HSC、ST-HSC 和MPP 的分布情況，與tSNE 和UMAP 結(jié)果相近。如圖4（c）所示，每種顏色線條代表Flow-SOM 分析所得的一組細(xì)胞，折線圖反映了8 組細(xì)胞中6 個(gè)抗原的表達(dá)變化情況，其結(jié)果與圖4（b）反映的情況相一致。

如圖5 所示，100 個(gè)單細(xì)胞以抗原表達(dá)情況為依據(jù)，形成聚類(lèi)分析結(jié)果。標(biāo)識(shí)顏色越相近、所在位置越相近的細(xì)胞，其抗原表達(dá)和細(xì)胞類(lèi)型越接近。著色的扇形標(biāo)識(shí)表示該抗原表達(dá)強(qiáng)弱情況，扇形標(biāo)識(shí)越大，該抗原表達(dá)越多。由圖5（c）可見(jiàn)，主要細(xì)胞群包括3 個(gè)，細(xì)胞比例最高的一群為ST-HSC（綠色），其CD34 表達(dá)為陽(yáng)性，CD16/32 表達(dá)為陰性。細(xì)胞比例次之的為L(zhǎng)T-HSC（紅色），其CD34 和CD16/32 表達(dá)均為陰性。細(xì)胞比例第三的為MPP（藍(lán)色），其CD34 和CD16/32表達(dá)均為陽(yáng)性。聚類(lèi)分析結(jié)果與3 種細(xì)胞的細(xì)胞群比例相符，呈依次降低關(guān)系（58.3%、22.0%、12.6%）。

圖3 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞UMAP 分析結(jié)果

圖4 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞FlowSOM 分析結(jié)果

圖5 小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式細(xì)胞FlowSOM 聚類(lèi)分析結(jié)果

3 討論

小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞流式檢測(cè)原理主要包括LSK（Lineage/Sca-1/c-kit）、SLAM（signaling lymphocytic activation molecule）和SP（side population）3 種方法，分別以Lineage/Sca-1/c-kit、CD48/CD150 和Hoechst33342 為主要識(shí)別標(biāo)志。本研究以LSK 方法為基礎(chǔ)，結(jié)合CD34 和CD16/32 標(biāo)記LT-HSC、STHSC 和MPP 進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析，為后續(xù)流式分選和小鼠骨髓造血干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。小鼠骨髓造血干細(xì)胞移植并檢測(cè)造血重建能力是研究造血干細(xì)胞干性的金標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)對(duì)研究造血干細(xì)胞的自我更新、多向分化、歸巢和發(fā)育等生物學(xué)功能有著十分重要的意義。因此，流式細(xì)胞檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析對(duì)造血干細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)揮著舉足輕重的作用。

流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析常見(jiàn)軟件包括FlowJo、FACS Diva、FACS Sortware 等，可以提供經(jīng)典的流式細(xì)胞表型、熒光蛋白、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、胞內(nèi)鈣動(dòng)員、染色體核型、磷酸化蛋白分析、活性氧分析及微小顆粒物分析等實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究必備的數(shù)據(jù)分析方法[16-17]。FACS Diva 和FACS Sortware 均可與流式細(xì)胞儀聯(lián)動(dòng)使用，分別為BD LSRⅡ、LSRFortessa、CantoⅡ、AriaⅢ及Influx 等型號(hào)流式細(xì)胞儀分析及分選實(shí)驗(yàn)提供軟件支撐。FACS Diva 界面設(shè)計(jì)友好，電壓調(diào)節(jié)、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、圈門(mén)十分方便，但導(dǎo)出流式圖片功能有待改善。FACS Sortware 主要為Influx分選儀提供支持，具有自動(dòng)輔助圈門(mén)的功能，避免流式門(mén)圈選重疊，造成分選混亂。FlowJo 是專(zhuān)為流式數(shù)據(jù)離線分析設(shè)計(jì)的軟件，以Excel 文件形式導(dǎo)出數(shù)據(jù)更加便捷，結(jié)合生物信息學(xué)降維分析，將傳統(tǒng)的逐級(jí)圈門(mén)流式分析方法進(jìn)行降維分析，形成可視化的數(shù)據(jù)圖形，有助于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞群體和獲得更為直觀的分析效果。與此同時(shí)，以FlowJo 為代表的流式數(shù)據(jù)分析軟件為白血病免疫分型、淋巴瘤分型、血液系統(tǒng)腫瘤微小殘留病及部分實(shí)體腫瘤檢測(cè)提供了科學(xué)的分析方法，有效地促進(jìn)了臨床血液學(xué)和腫瘤生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[18-19]。基于流式細(xì)胞術(shù)的不斷深入發(fā)展，流式數(shù)據(jù)分析方法研究也不斷向前發(fā)展，結(jié)合生物信息學(xué)方法，為多激光多色流式分析和高速高通量流式分選實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)[20]。

本研究采用tSNE、UMAP 和FlowSOM 分析與傳統(tǒng)流式分析方式相比較的方法，分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞。tSNE 和UMAP 依據(jù)不同的算法對(duì)流式數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，使圖形可視化水平更好。FlowSOM 對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行聚類(lèi)分析，以樹(shù)狀圖的形式反映被測(cè)細(xì)胞間的相互關(guān)系和抗原表達(dá)水平。這3 種FlowJo 軟件分析功能所得結(jié)果反映了LTHSC、ST-HSC 和MPP 的分布情況，豐富了數(shù)據(jù)的表征形式，與傳統(tǒng)流式分析方式所得細(xì)胞群比例相符，印證了tSNE、UMAP 和FlowSOM 分析方法的可行性和穩(wěn)定性。本研究關(guān)注的小鼠造血干細(xì)胞流式分析是實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，但缺乏造血系統(tǒng)其他細(xì)胞如定向祖細(xì)胞及成熟細(xì)胞的流式分析，且與以熱圖為表征的聚類(lèi)分析結(jié)合不夠緊密。在未來(lái)的研究中，將以小鼠為模式生物的髓系祖細(xì)胞（common myeloid progenitor，CMP）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（granulocyte-macrophage progenitor，GMP）、髓系-紅系祖細(xì)胞（myelo-erythroid progenitor，MEP）、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等造血細(xì)胞納入分析，將基于Flowjo 軟件平臺(tái)的生物信息學(xué)流式細(xì)胞分析研究推向深入。

綜上，流式細(xì)胞術(shù)與FlowJo 軟件生物信息學(xué)分析方法相結(jié)合，可以很好地檢測(cè)、分析小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞各群分布和比例，反映群體細(xì)胞的抗原表達(dá)水平，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群和聚類(lèi)，并且可以提供傳統(tǒng)流式分析方法所不具備的直觀視角，有助于造血干細(xì)胞生物學(xué)的研究發(fā)展，具有深遠(yuǎn)的科研和臨床意義。