楊亞楠，于時(shí)卉，閆香珍，羅禮君

牙周優(yōu)勢(shì)致病菌如牙齦卟啉單胞菌(porphyromonasgingivalis,Pg)入侵組織后引發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞極化在牙周炎發(fā)病過(guò)程中至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞在牙周組織中廣泛存在，可以通過(guò)識(shí)別清除病原體、殺傷靶細(xì)胞、抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等功能維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。巨噬細(xì)胞主要有兩種不同的激活狀態(tài)：經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages, CAMs)，即M1型；選擇性活化型巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages, AAMs)，也稱M2型。在感染初期，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的M1表型，當(dāng)直接危險(xiǎn)因素去除后，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈挚寡装Y的M2表型，以適應(yīng)機(jī)體對(duì)炎癥消除和損傷修復(fù)的需要。M1、M2激活失衡或表型轉(zhuǎn)換的時(shí)機(jī)錯(cuò)亂都可能導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法對(duì)感染和損傷做出合理的免疫反應(yīng)，促進(jìn)牙周炎的發(fā)展和組織損傷的加重。

目前，超過(guò)90%的糖尿病(diabetes mellitus, DM)是以胰島細(xì)胞功能受損、胰島素抵抗為特征的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)。而巨噬細(xì)胞極化在胰島素抵抗中的作用尤其顯著[1-2]。在肥胖人群中，T2DM的發(fā)生往往以慢性炎癥為特征?，F(xiàn)有研究表明，被招募到脂肪組織的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1型激活，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-6、IL-1β)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗[3-5]。另一方面M2型巨噬細(xì)胞不僅抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，而且還通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)抑制脂肪前體細(xì)胞的增殖，從而維持胰島素的敏感性。目前, 許多研究已經(jīng)證實(shí)了糖尿病與牙周炎的雙向關(guān)系，二者疾病嚴(yán)重程度往往呈現(xiàn)相關(guān)性[6-9]，提示控制血糖、血脂代謝對(duì)伴T2DM 慢性牙周炎患者牙周治療效果意義重大。另一方面，牙周炎作為慢性炎癥對(duì)糖尿病的代謝控制具有負(fù)面影響，慢性牙周炎目前被公認(rèn)是導(dǎo)致血糖控制不佳的危險(xiǎn)因素之一。

本課題組前期研究證實(shí)在C57BL/6J野生型小鼠中，Pg感染巨噬細(xì)胞可引起其向M1極化，加重組織損傷，而誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞去極化或促使其向M2極化轉(zhuǎn)變對(duì)減少損傷和促進(jìn)組織修復(fù)具有重要意義[10]。本研究旨在初步探討Pg對(duì)db/db小鼠(2型糖尿病小鼠)骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)的極化作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀(Bio-rad，美國(guó))，Lightcycler480型熒光定量PCR儀(Roche，美國(guó))。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone，美國(guó))，胎牛血清(Gibco，美國(guó))，青霉素鏈霉素溶液(Invitrogen, 美國(guó))，Trizol(Life Technologies, 美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, 日本)，SYBR Green qRT-PCR試劑盒(Toyobo，日本)，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(康潤(rùn)，中國(guó))，無(wú)菌脫纖維羊血(康潤(rùn)，中國(guó))，厭氧袋(三菱，日本)，氯化血紅素(國(guó)藥，中國(guó))，維生素K1注射液(阿拉丁，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 分別選取6～8周齡的C57BL/6J WT小鼠(來(lái)自南京生物醫(yī)藥研究院)和此來(lái)源的db/db小鼠，頸椎脫臼法處死，將小鼠浸泡于75%乙醇中30 s～1 min充分消毒，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中。無(wú)菌下分離股骨頭與髖骨，去除腿骨表面皮膚，將股骨與脛骨完整取出后置于PBS溶液中，剝除骨骼上附著的肌肉組織，分離股骨與脛骨。剪去骨骼兩端后，將裝有DMEM培養(yǎng)液1 mL無(wú)菌注射器針頭插入骨髓腔，將骨髓反復(fù)沖洗至15 mL離心管中，直至骨髓腔變白。室溫下，500g、10 min離心細(xì)胞后，棄上清，加入含20 ng/mL的M-CSF的DMEM培養(yǎng)液[11-13]，以1×106個(gè)/孔鋪于12孔板。在37 ℃、5% CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 牙齦卟啉單胞菌培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，將PgATCC33277(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所李鳴宇教授饋贈(zèng))溶于80～100 μL的羊血后均勻涂布于血平板上，置于厭氧罐內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)。4～5 d后，血平板上見(jiàn)黑色光亮、圓形的單個(gè)菌落，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單克隆至無(wú)菌腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，在厭氧條件下培養(yǎng)24～48 h。通過(guò)菌落形態(tài)、革蘭陰性染色等方法鑒定Pg為純培養(yǎng)后，5 000 r/min、5 min離心，棄上清，PBS清洗3遍，液體培養(yǎng)基重懸。比濁儀檢測(cè)菌液在波長(zhǎng)600 nm處吸光值約0.5時(shí)，Pg濃度約1×109個(gè)/mL。

1.2.3 qRT-PCR 法檢測(cè)db/db小鼠BMDMs中極化標(biāo)志物基因表達(dá)情況 (1)將WT和db/db小鼠來(lái)源的BMDMs鋪板，設(shè)立空白對(duì)照組、Pg組、IL-4組和Pg+IL-4組，分別加入Pg(MOI=50)和/或IL-4(20 ng/mL)刺激后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。之后在4、16 h時(shí)收樣，-20 ℃保存。(2)采用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度與純度并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用基因特異性引物和SYBR Green qRT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Pg對(duì)db/db小鼠BMDMs向M2極化的抑制作用減弱

糖尿病是牙周炎的高危因素，為了探討糖尿病對(duì)Pg誘導(dǎo)下的巨噬細(xì)胞M1極化的影響，我們從db/db小鼠中分離出BMDMs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)在Pg或/和IL-4的刺激下，db/db小鼠BMDMs中M1標(biāo)志物Tnf-α、Il-12以及M2標(biāo)志物Arg1、Ym1、Fizz1和Mrc1的基因相對(duì)表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WT小鼠的BMDMs在IL-4以及IL-4+Pg誘導(dǎo)下，M2極化標(biāo)志基因Arg1、Fizz1和Mrc1的表達(dá)顯著降低；而db/db小鼠BMDMs在IL-4誘導(dǎo)下，有無(wú)Pg感染，上述基因的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A，1B，1C)，Ym1的表達(dá)明顯下降(圖1D)，表明糖尿病能夠部分削弱Pg對(duì)巨噬細(xì)胞向M2極化的抑制作用。

Arg1(A)、Fizz1(B)、Mrc1(C)和Ym1(D)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。*:P< 0.05, **：P<0.01, N.S.指無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖1Pg對(duì)IL-4誘導(dǎo)下的BMDMs表達(dá)M2標(biāo)志基因的影響

Fig.1Effects ofPgon expression of M2markergenes of IL-4induced BMDMs

2.2 Pg促進(jìn)db/db小鼠BMDMs向M1極化的作用減弱

實(shí)驗(yàn)同上，WT組，Pg上調(diào)M1極化標(biāo)志基因Tnf-α的表達(dá)，且在IL-4的同時(shí)作用下，M1基因表達(dá)無(wú)明顯下降；然而，db/db組Pg與IL-4協(xié)同刺激時(shí)，Tnf-α的表達(dá)量明顯下調(diào)(圖2A)。相較于WT小鼠，db/db小鼠Pg誘導(dǎo)BMDMs表達(dá)M1標(biāo)志物Il-12的能力顯著下調(diào)(圖2B)。結(jié)果顯示Pg促進(jìn)db/db小鼠BMDMs向M1極化的作用減弱。綜上所述，Pg對(duì)同種極化類型的BMDMs標(biāo)志基因的影響并不是完全一致的，但在db/db小鼠中，巨噬細(xì)胞向M1極化整體呈現(xiàn)衰減的趨勢(shì)。

Tnf-α(A)和Il-12(B)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。*：P< 0.05, ** ：P<0.01, N.S.指無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖2Pg對(duì)IL-4誘導(dǎo)下的BMDMs表達(dá)M1標(biāo)志基因的影響

Fig.2Effects ofPgon expression of M1marker genesof IL-4induced BMDMs

3 討 論

兩種不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞分別對(duì)應(yīng)不同的病原刺激物，細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和受損組織釋放的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)等病原成分刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生經(jīng)典激活，合成并釋放大量的炎癥性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)等，參與細(xì)胞內(nèi)病原體的清除和牙周組織的損傷及破壞[14]；而IL-4和IL-13誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生選擇性激活，激活后的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)抵抗素樣分子-α(resistin-like-α, RELMα/Fizz1)、殼多糖酶3樣蛋白-3(chitinase 3-like 3, CHI3L3/Ym1)、精氨酸酶-1(arginase 1, Arg1)、甘露糖受體C-1(mannose receptor C-Type 1, Mrc1)和IL-10等分子，抑制寄生蟲(chóng)感染和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷的修復(fù)和組織重建[15]。我們前期研究表明Pg通過(guò)抑制αKG代謝通路中相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化[10]。本研究結(jié)果顯示，在糖尿病小鼠來(lái)源的同種極化類型的骨髓巨噬細(xì)胞中，M1和M2標(biāo)志基因的表達(dá)趨勢(shì)并不是完全一致的，Pg對(duì)M1極化的促進(jìn)功能和IL-4對(duì)M2極化的誘導(dǎo)作用都遭到了一定程度的削弱，

db/db小鼠指瘦素受體突變的小鼠，這種基因敲除小鼠提供了一種單基因T2DM動(dòng)物模型，具有肥胖和早期胰島素抵抗的特征[16-17]。瘦素調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥過(guò)程[18-19]，炎癥刺激如TNF-α, IL-1或LPS刺激脂肪組織表達(dá)瘦素，反過(guò)來(lái)，瘦素促進(jìn)細(xì)胞增殖、生存、遷移、趨化作用，細(xì)胞因子、蛋白酶和粘附分子的表達(dá)以及氧化應(yīng)激。因此，瘦素受體的突變可能影響炎癥因子的表達(dá)。5～28周齡的db/db小鼠不僅有典型糖尿病臨床表現(xiàn),也表現(xiàn)出心肌病、周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、傷口愈合遲滯等糖尿病的并發(fā)癥[20]，這些疾病的常見(jiàn)表現(xiàn)是過(guò)度纖維化和組織重構(gòu)，通常與M2巨噬細(xì)胞有關(guān)，而非炎性M1巨噬細(xì)胞，所以db/db小鼠中M2巨噬細(xì)胞的表達(dá)可能是增加的[21]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病的發(fā)展與db/db小鼠胃黏膜組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加和這些巨噬細(xì)胞中血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的上調(diào)有關(guān)，這些巨噬細(xì)胞呈CD206陽(yáng)性即M2巨噬細(xì)胞[22]。

瘦素信號(hào)在維持吞噬功能中似乎是必需的，具有促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的能力[23]。有研究提出假設(shè)，肥大細(xì)胞(MCs)產(chǎn)生的IFN-γ和IL-6可能導(dǎo)致ob/ob 小鼠(即瘦素基因突變小鼠)來(lái)源的BMDMs減少向M1極化，來(lái)自ob/ob 骨髓肥大細(xì)胞的IFN-γ，IL-6和IL-13和其他未經(jīng)檢測(cè)的介質(zhì)可能有助于增強(qiáng)巨噬細(xì)胞IL-4表達(dá)和M2巨噬細(xì)胞極化[24]。MCs與BMDMs體外共培養(yǎng)后，IL-4刺激后精氨酸酶-1和IL-10表達(dá)增加，但是抑制了脂多糖(LPS)刺激后誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和IL-6的表達(dá)[24]。而ob/ob和db/db小鼠均是理想的2型糖尿病動(dòng)物模型，由此我們推測(cè)db/db小鼠骨髓中的肥大細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可能促使BMDMs在Pg作用下仍高表達(dá)部分M2標(biāo)志基因。

綜上所述，Pg對(duì)db/db小鼠的BMDMSs向M1極化的促進(jìn)作用減弱可能是由于在瘦素受體突變下IL-4誘導(dǎo)M2型的作用更敏感。但是Pg對(duì)糖尿病小鼠巨噬細(xì)胞極化機(jī)制的影響尚需深入研究。