吳澤鈺，薛 瑞，袁曦玉，從兆霞，趙 今

齲病是最常見的口腔疾病，是以細菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的疾病[1]。中藥中的植物藥被認為是一類有效防治齲病的藥物[2]。植物藥以粗提取物的形式治療各種疾病，被證實具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[2]，植物藥制劑已經(jīng)在齲病和牙髓疾病的治療中廣泛應用[2-3]。青皮 (Citrusreticulate) 為蕓香科植物橘(CitrusreticulateBlanco)的干燥幼果或未成熟果實的果皮；味苦、辛, 性溫；歸肝、膽、胃經(jīng)；具有疏散退熱、舒肝解郁等作用[4]。青皮主要成分為多種氨基酸、黃酮類化合物等,柚皮素和柚皮苷為其主要防齲抑菌的有效活性成分。

網(wǎng)絡藥理學(network pharmacology) 是結合系統(tǒng)生物學、多向藥理學和網(wǎng)絡分析等技術，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡的基礎上，利用網(wǎng)絡分析軟件計算，系統(tǒng)、整體地揭示疾病-疾病、疾病-靶點、靶點-藥物之間的關聯(lián)[5]。本文采用網(wǎng)絡藥理學方法從整體性的角度對青皮的防齲作用機制進行探討，并使用青皮粗提取物對主要致齲細菌的生長產(chǎn)生影響，為進一步研究青皮臨床應用價值提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 體外抑菌試驗

1.1.1 藥材提取 購買干燥青皮藥材(購自新疆參茸中維藥飲片有限公司)，粉碎，過60目篩。稱取500 g青皮粉末浸泡于95%乙醇中浸提24 h，重復浸提3次，料液比1∶10，合并3次浸取液。將浸取液抽濾，濾液旋轉蒸發(fā)器40 ℃下減壓濃縮至無乙醇餾出為止, 在低溫冷凍干燥放置冰箱4 ℃以下備用。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基 變形鏈球菌(S.mutansUA159)、血鏈球菌(S.sanguisATCC10556)、遠緣鏈球菌(S.sobrinusATCC6715)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilusATCC4356)、黏性放線菌(A.viscosusATCC19246)、內(nèi)氏放線菌(A.naeslundiiATCC12104)以上菌株均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。腦-心浸液培養(yǎng)基(BHI)：稱量3.7 g BHI培養(yǎng)基，加100 mL蒸餾水溶解，121 ℃ 15 min高壓滅菌，調(diào)整pH=7.0±0.2。嗜酸乳桿菌用乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)培養(yǎng)。

1.1.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)及最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的測定 青皮提取物按二倍稀釋法溶于含1%葡萄糖BHI、MRS液體培養(yǎng)基中，最終濃度8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 g/L(DMSO的最終濃度為1%，無殺菌作用)。分光光度計調(diào)整菌懸液密度至1×107cfu/mL(OD630=0.2)備用，將菌懸液與藥液按照1∶1(V∶V)比例，各100 μL接種于96孔板中。用震蕩l min后，變形鏈球菌、血鏈球菌、遠緣鏈球菌和內(nèi)氏放線菌置于厭氧條件(80%N2，20%CO2)，黏放線菌和嗜酸乳桿菌置于5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。ΔOD≤0.05的最低濃度為MIC。選擇>MIC濃度的各孔，取20 μL涂布于BHI、MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)少于5～6個的最低濃度為MBC。重復3次。

1.2 青皮化學成分篩選及作用基因獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索青皮的化學成分，查閱并整理化學成分及作用靶點。利用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和ChemBL(https://www.ebi.ac.uk)確定青皮化學成分三維結構，建立青皮化學成分的數(shù)據(jù)庫。將基因名轉換為UniProt數(shù)據(jù)庫中的Gene Symbol。

1.3 齲病靶點基因的篩選

通過在Gene Cards (https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/search)中輸入關鍵詞dental caries、caries等搜索相關基因，與上述青皮化學成分的藥物作用靶點進行匹配，得到青皮化學成分防齲的潛在作用靶點。

1.4 成分-作用靶點網(wǎng)絡構建與分析

為了闡明青皮化學成分防齲機制，構建了化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡，預測成分與靶點對應關系。將青皮化學成分、作用靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，然后利用 Network Analyzer工具計算網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括度值(degree)、拓撲系數(shù)(topological coefficient)[6]。采用網(wǎng)絡分析方法，確定關鍵節(jié)點，探討青皮化學成分的主要作用靶點及其作用機制。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù)

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[7](https://string-db.org)提供預測靶點蛋白之間的作用網(wǎng)絡。物種限于“Homo sapiens”，置信度得分>0.4。選擇連接前10個的靶基因作為青皮防齲過程的中心基因。

1.6 基因本體(gene ontology, GO) 富集分析

生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID, https://david.ncifcrf.gov)為大規(guī)?；蚧虻鞍琢斜硖峁┫到y(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，找出顯著富集的生物學注釋[8]。使用DAVID對靶點進行GO富集分析[9]，用FDR<0.05對P值作檢驗校正，最終閾值P<0.01，篩選有顯著性差異的生物過程，利用R軟件繪圖。

1.7 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析

使用KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)[10]對靶點進行富集分析。輸入物種為“Homo Sapiens”，輸入靶點，進行KEGG[11]信號通路富集分析以及相關的通路圖，并利用R軟件繪圖。

2 結 果

2.1 青皮提取物對6種主要致齲菌MIC、MBC結果

實驗結果表明，青皮提取物對6種主要致齲菌均存在抑制作用，青皮提取物濃度分別為1.0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.0, 2.0 g/L的S.mutans,S.sanguis,S.sobrinus,A.viscosus,A.naeslundiiandL.acidophilus菌液明顯澄清，酶標儀測ΔOD<0.05。結果詳見表1。

表1 青皮提取物對6種主要致齲菌MIC、MBC的實驗結果Tab.1 MIC and MBC values of Citrus reticulate extract to the six main cariogenic bacteria g/L

2.2 青皮化學成分的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得青皮化學成分18個,根據(jù)青皮各成分的含量、生物利用度(OB)、類藥性(DL)結合本實驗室的研究篩選出潛在防齲作用的化學成分12個, 詳見表2。

2.3 青皮作用于齲病相關靶點

青皮的12個化學成分在TCMSP、Drugbank數(shù)據(jù)庫中獲得靶點232個, 去重后92個。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索靶點Gene symbol。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫得到1 171個齲病相關基因, 與青皮作用靶點進行比對取交集, 篩選出28個可能與青皮防齲相關的作用靶點, 詳見圖1，表3。

圖1 Venn圖Fig.1 Venn diagram

表2 用于網(wǎng)絡藥理分析的青皮的化學成分Tab.2 Chemical components of Citrus reticulate for network pharmacology analysis

表3 可能與青皮預防齲病相關的靶點Tab.3 Targets related to the prevention of caries

2.4 化合物-靶點網(wǎng)絡構建與分析

運用Cytoscape軟件構建成分-靶點網(wǎng)絡，如圖2所示。圖中共42個節(jié)點(12個成分，28個靶點)和1 722條邊。網(wǎng)絡拓撲學結構分析顯示，化合物的平均度數(shù)為5.917，說明青皮防齲有多靶點屬性，其中度數(shù)較大(度數(shù)>10)的化合物為柚皮素、川陳皮素?；衔锿負鋵W參數(shù)見表2。同時，許多靶點與多種成分相關，這可能表明青皮發(fā)揮藥效過程中不同化合物具有協(xié)同作用。

圖2 青皮化合物-靶點網(wǎng)絡圖Fig.2 Citrus reticulate chemical components-targets network diagram

2.5 蛋白-蛋白網(wǎng)絡構建與分析

STRING獲取28個靶點的PPI關系。選擇組合得分>0.4，PPI關系網(wǎng)絡有28個節(jié)點和156個邊緣(圖3A)。選擇連接性最高的10個靶基因作為防齲的中心基因(圖3B)， 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、 半胱天冬酶-3(caspase 3，CASP3)、 過氧化氫酶(catalase，CAT)、 絲裂原激活的蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)等。

A：每個節(jié)點代表相關靶點，邊緣越多，關聯(lián)越強；B：PPI網(wǎng)絡中的基因邊緣數(shù)排序

圖3青皮化學成分預防齲病靶蛋白-蛋白相互作用

Fig.3Citrusreticulatechemical components prevent cariesTargets protein-protein interaction

2.6 GO富集分析

David數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，參數(shù)設置P<0. 01，得到74個注釋信息，分為：①生物過程(biological Process，BP)，獲得52條結果，主要涉及對過氧化氫的反應、對糖皮質(zhì)激素的反應、對缺氧的反應等方面;②分子功能(molecular function，MF)，獲得11條結果，主要涉及蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白結合、蛋白酶結合等方面;③細胞組分(cellular component，CC)，獲得11條結果，線粒體、細胞外泌體、細胞質(zhì)等方面，見表4，圖4。

2.7 KEGG通路富集分析

利用KOBAS數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路富集分析，P<0.01，F(xiàn)DR校正后的Q<0.01共獲得110條結果。前20條通路，包括了4條信號通路(AGE-RAGE、TNF、NF-κB、HIF-1和癌癥通路)，6條生物系統(tǒng)相關通路(內(nèi)分泌抵抗，細胞凋亡，5-羥色胺能突觸等) 和10條疾病通路(乙型肝炎，肌萎縮側索硬化癥，結直腸癌等)。見表5，圖5。

表4 青皮對相應基因GO富集分析結果(各前5條)Tab.4 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes GO enrichment analysis (Top 5)

表5 青皮對相應基因KEGG富集分析(前10條)Tab.5 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes KEGG enrichment (Top 10)

圖4 潛在靶點生物學過程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets biological processes

圖5 潛在靶點生物學過程的KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of potential targets biological processes

3 討 論

植物藥衍生的次級代謝產(chǎn)物，包括不同類型的黃酮類物質(zhì)、糖苷、生物堿等，大多是潛在的天然抑菌物質(zhì)[12]。利用植物藥防治齲病是目前研究的熱點。本實驗結果表明，青皮提取物能夠有效抑制主要致齲菌的生長，對鏈球菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，具有一定的殺菌作用。國內(nèi)外相關研究表明，青皮提取物對多種細菌的生長具有抑制作用，陳青等[13]研究青皮揮發(fā)油對金葡菌等有抑菌作用，MIC在0.31～1.25 g/L；Yue等[14]研究發(fā)現(xiàn)柚皮素對變形鏈球菌的MIC在100～200 μg/mL,且減少生物膜形成，都與本研究結果一致。青皮中發(fā)揮抑菌作用的成分主要為柚皮素、柚皮苷、橙花醛等。于倩等[15]研究表明伊犁黑蜂蜂膠對主要致齲菌的MIC為4、2、8、2、1 g/L，李夢琪等[16]研究發(fā)現(xiàn)紫地榆對致齲菌的MIC為0.5～4.0 g/L。本實驗結果發(fā)現(xiàn)青皮提取物對致齲菌的MIC濃度低于蜂膠及紫地榆提取物，提示青皮可能是效果更佳的潛在防齲藥物。

網(wǎng)絡藥理學方法整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體辨證原則不謀而合[17]。本研究利用網(wǎng)絡藥理學，構建“青皮-成分-靶標-齲病”調(diào)控網(wǎng)絡，系統(tǒng)分析青皮化學成分多途徑防治齲病的潛在機制。最終獲得12個成分，28個靶點，調(diào)控網(wǎng)絡顯示柚皮素、甜橙黃酮、萜基烯等匹配多靶點，是青皮防齲關鍵成分。靶點中TNF、CASP3、CAT等處于網(wǎng)絡中心位置，可能是青皮防齲調(diào)控網(wǎng)絡的潛在調(diào)節(jié)因子。研究證明川陳皮素、柚皮素能抑制TNF、 基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表達[18-19]。齲病發(fā)生時，細菌刺激牙髓單核/巨噬細胞、中性粒細胞系統(tǒng)等產(chǎn)生TNF，激活免疫系統(tǒng)參與清除感染[20]。MMPs 家族是重要的生物活性劑，參與了病理過程中細胞外基質(zhì)的崩解，能夠調(diào)節(jié)牙本質(zhì)修復的潛能[21]。

將28個靶點進行GO富集分析，青皮化學成分主要涉及蛋白結合、蛋白酶結合、對過氧化氫的反應等生物過程，涉及細胞器、細胞膜和細胞質(zhì)等細胞組分，是一個復雜的調(diào)控過程。KEGG富集分析獲得110條結果，青皮防齲的潛在信號通路主要為年齡-糖基化終產(chǎn)物受體蛋白信號通路(age-receptor for advanced glycation endproducts signaling pathway，AGE-RAGE通路)、TNF通路、NF-κB通路(核因子-κB信號通路，nuclear factor -kappa B signaling pathway)等。其中AGE-RAGE信號通路能夠激活多條信號轉導通路，如TNF、NF-κB信號通路、信號轉導蛋白和轉錄途徑等[22]，NF-κB活化又可上調(diào)RAGE。AGE-RAGE激活NF-κB或其他途徑釋放與齲病相關的細胞因子，如TNF、MMP、 前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)等[23]，能夠促進氧化應激，降低抗氧化酶，降低糖的利用，抑制細菌定植于牙面。

本研究既探討青皮提取物對主要致齲菌生長抑制作用，又應用網(wǎng)絡藥理學方法對青皮潛在防齲的成分、作用靶點和機制進行了探索性研究。由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面，未考慮不同化學成之間的協(xié)同作用等影響，網(wǎng)絡預測的結果具有一定的片面性和局限性。但是，初步驗證了青皮能有效抑制主要致齲菌的生長，以及網(wǎng)絡藥理學也顯示出青皮防治齲病的藥理活性及作用機制，為將來進一步深入探討防齲機制的研究提供了實驗和理論依據(jù)。