李佳靈，尹為治，方正，黃良鴻

（1.海南熱帶雨林國家公園管理局五指山分局，海南 五指山 572299；2.海南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南海口 570228）

“名不正則言不順，言不順則事不成”。本文所用基本術(shù)語均源自英文，學(xué)界用詞尚未統(tǒng)一，造成較大混亂。為便于論述，特定義解釋如下。

密碼子（codon）：DNA 或mRNA 上三個(gè)相鄰的堿基。共64 種，其中61 種編碼氨基酸，其余3種為終止密碼子。

同義密碼子（synonymous codon），簡稱同義碼：編碼同一種氨基酸的多個(gè)密碼子。生物體中使用的氨基酸有20 種，其中2 種各擁有1 種密碼子，其余18 種各擁有2～6 種同義密碼子。

密碼子役傭（codon usage），簡稱碼役：密碼子被基因序列役使征用以編碼氨基酸，多被譯為“密碼子使用”。事實(shí)上密碼子是被使用，不是密碼子使用什么。因此，“役傭”一詞較“使用”更能精確表達(dá)“usage”原意。

同義密碼子役傭偏好（synonymous codon usage bias），簡稱碼役偏好。同義密碼子非均衡役傭現(xiàn)象，基因偏好役用同義密碼子中的某種或某幾種。

同義密碼子氨基酸族（synonymous family），簡稱碼族：擁有相同數(shù)目同義密碼子的氨基酸家族。一碼族含2 個(gè)成員，各自擁有1 種密碼子；二碼族含9 個(gè)成員，各自擁有2 種同義密碼子；三、四、六碼族分別含1、5、3 個(gè)成員，各自分別擁有3、4、6 種同義密碼子。

最優(yōu)密碼子（optimal codon）：在基因組多數(shù)基因中役用頻率超過平均水平且在高表達(dá)基因中役用頻率較高的一組同義密碼子。最優(yōu)密碼子的篩選標(biāo)準(zhǔn)隨研究目的、對象而異。

現(xiàn)役密碼子，簡稱現(xiàn)役碼：出現(xiàn)在基因序列，役傭于基因的密碼子。

在編氨基酸：被基因編碼，其密碼子役傭于基因的氨基酸。

碼役偏好與基因組和蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)，生物學(xué)意義巨大[1,2]。目前，所有被研究過的物種都有著不同程度的碼役偏好[3]。碼役偏好受自然選擇、堿基突變、基因漂變等因素共同作用[4]，還受到基因組大小[5]、tRNA 豐度[6]等因素影響。了解不同物種的碼役模式，分析其影響因素，可以推斷未知基因的表達(dá)，預(yù)測未知基因的功能[1]。

伯樂樹Bretschneidera sinensis 系第三紀(jì)孑遺植物，單種成科，我國特有種，1999 年被列為國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)植物[7]。伯樂樹葉綠體已經(jīng)完成測序[8]，尚未有其碼役等方面的研究報(bào)道。在已有的研究基礎(chǔ)上，通過對伯樂樹葉綠體基因碼役偏好的分析，揭示其主要影響因素，確定最優(yōu)密碼子，本研究旨在為伯樂樹葉綠體基因組學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載伯樂樹葉綠體全基因組序列信息，登錄號為NC_037753.1，共下載87 條基因編碼序列，排除重復(fù)或較短的序列，獲得53 個(gè)基因作為分析樣本。樣本基因均以ATG 為起始密碼子，以TAG、TGA 或TAA 為終止密碼子，且編碼區(qū)長度大于300 bp。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22 及R 語言完成。

1.2 研究方法

1.2.1 碼役偏好統(tǒng)計(jì)參量計(jì)算

運(yùn)用CodonW1.4.2 和德泰生物的序列操作工具箱（http://www.detaibio.com/sms2/index.html），在線統(tǒng)計(jì)樣本序列編碼區(qū)長度（Sequence Length，縮寫表示為SL），使用下述公式計(jì)算樣本序列碼役偏好統(tǒng)計(jì)參量。

1）GC 含量

式中：G、C 分別為樣本基因現(xiàn)役碼同位點(diǎn)堿基G、C 的出現(xiàn)次數(shù)；GC 為現(xiàn)役碼同位點(diǎn)堿基G+C 含量；i 為堿基位點(diǎn)序號，取值1、2、3；N 為樣本基因現(xiàn)役碼總數(shù)，GC12為GC1和GC2的平均值，GCall為樣本基因總體GC 含量。GC 含量反映方向性突變壓力的強(qiáng)弱，GC3與碼役偏好關(guān)系密切。

2）堿基偏倚度[9]

式中：PA、PG分別為樣本基因現(xiàn)役碼第3 位堿基A、G 的偏倚度，A3、T3、G3、C3分別為現(xiàn)役碼第3 位堿基A、T、G、C 的含量，“|4”表示可計(jì)算4 種同義碼的四、六碼族的在編氨基酸，對于六碼族的在編氨基酸，排除第3 位堿基相同的2 種現(xiàn)役碼，僅取4 種進(jìn)行計(jì)算。

根據(jù)奇偶規(guī)則（Parity Rule 2，PR2），DNA 互補(bǔ)鏈之間如果不存在選擇性偏倚或突變，則堿基含量A 與T 相等，G 和C 相等。為避免密碼子第3 位AT 和GC 之間突變不平衡，僅對四、六碼族的在編氨基酸做現(xiàn)役碼第3 位堿基分析[9]。

3）有效密碼子數(shù)[1]（Effective Number of Codon，ENC）

中文文獻(xiàn)通行譯effctive 為“有效”，其實(shí)該處effctive 含義為密碼子被基因序列役使征用而生效以實(shí)際編碼氨基酸，即被基因役用，類似于服役。因此，譯effctive 為“現(xiàn)役”不僅更為準(zhǔn)確，而且能夠避免因“有效”含義寬泛造成的誤解。相應(yīng)地，術(shù)語整體譯為密碼子現(xiàn)役數(shù)，簡稱現(xiàn)役碼數(shù)。為交流方便，本文仍采用“有效密碼子數(shù)”這一通行詞。

式中：ENCbias為樣本基因現(xiàn)役碼偏好數(shù)，碼役偏好（bias）受突變和選擇壓力雙重影響；i 為氨基酸碼族號（取值2、3、4、6）；j 為在編氨基酸序號；k 為現(xiàn)役碼序號；n 為現(xiàn)役碼數(shù)量；m 為在編氨基酸的現(xiàn)役碼數(shù)目；N 為碼族中在編氨基酸數(shù)目，小于或等于碼族成員數(shù)；p 為現(xiàn)役碼頻數(shù)；f 為在編氨基酸的現(xiàn)役碼一致性指數(shù)；F 為碼族中在編氨基酸平均一致性指數(shù)，fij=0 時(shí)視同為非在編氨基酸，不參與F 值計(jì)算。ENCbias反映碼役偏離隨機(jī)選擇的程度，最小值為20，反映每個(gè)氨基酸只有1個(gè)現(xiàn)役碼的極端情況；最大值為61，反映全部氨基酸均在編且每個(gè)密碼子均被均衡使用的極端情況。該值越小，碼役偏好越強(qiáng)，基因表達(dá)強(qiáng)度一般越高。

式中：ENCmuta為樣本基因現(xiàn)役碼理論數(shù)，碼役僅受到突變（mutation）影響；GC3為密碼子第3位堿基G+C 含量。

式中：RENC 為樣本基因現(xiàn)役碼數(shù)比值，ENCmuta為現(xiàn)役碼理論數(shù)，ENCbias為現(xiàn)役碼偏好數(shù)。

4）同義碼相對使用度（Relative Synonymous Codon Usage,RSCU）

式中：RSCU 為樣本基因現(xiàn)役碼相對使用度；x 為現(xiàn)役碼數(shù)量；m 為在編氨基酸的現(xiàn)役碼數(shù)目，取值2～6；i 為在編氨基酸序號；j 為現(xiàn)役碼序號。RSCU＞1，表明其碼役頻率相對較高，反之亦然。

1.2.2 中性繪圖分析

以GC12為縱坐標(biāo)、GC3為橫坐標(biāo)，分析GC3與GC12的相關(guān)性，若二者呈顯著相關(guān)關(guān)系，說明堿基的變異模式相同，碼役受突變的影響較大；反之則表示基因有較高的保守性，碼役受選擇壓力的影響較大[9]。

1.2.3 奇偶偏好繪圖分析

以PA為縱坐標(biāo)，PG為橫坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，分析堿基使用偏好及其影響因素。

1.2.4 有效密碼子數(shù)繪圖分析

以樣本基因ENCbias、GC3為縱、橫坐標(biāo)，用R語言做散點(diǎn)圖，并與ENCmuta曲線進(jìn)行比較。當(dāng)樣本基因點(diǎn)分布于ENCmuta曲線附近時(shí)碼役偏好受突變影響，樣本基因點(diǎn)多分布于ENCmuta曲線下方較遠(yuǎn)位置時(shí)碼役偏好較多受選擇壓力的影響[10]。

1.2.5 對應(yīng)性分析

根據(jù)功能對每個(gè)樣本基因進(jìn)行分類，基于每個(gè)基因的RSCU 進(jìn)行。將53 條樣本基因分布到59 維RSCU 向量空間（排除一碼族，共計(jì)59 個(gè)密碼子，每個(gè)密碼子為1 維），通過主成分分析降維后，檢測分布在主向量軸上的樣本基因的相對位置，推測碼役的主要影響因素。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析

基于ENCbias排序53 個(gè)樣本基因，從兩極各選出10%各5 個(gè)基因作為高、低表達(dá)組分別計(jì)算RSCUtop、RSCUbot，計(jì)算RSCUtop、RSCUbot之差△RSCU。篩選△RSCU＞0.08 的現(xiàn)役碼作為高表達(dá)優(yōu)越密碼子。與53 個(gè)樣本基因總體現(xiàn)役碼相對使用度RSCUall進(jìn)行綜合比較，將△RSCU＞0.08，且RSCUall＞1 的現(xiàn)役碼定義為最優(yōu)密碼子[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)役碼組成分析

分析表1 得出，53 個(gè)樣本基因總體GC1為45.93%，GC2為37.93%，GC3為29.10%。不同位置的GC 含量較大不同，呈現(xiàn)從第1 位到第3 位遞減的分布趨勢，樣本基因現(xiàn)役碼偏向于以A/T結(jié)尾。ENCbias大小可以反映碼役偏好強(qiáng)弱[12]。53 個(gè)樣本基因ENCbias范圍為37.22～56.50，其中39 個(gè)基因ENCbias＞45，說明伯樂樹葉綠體基因碼役偏好較弱。

表2顯示，GC3與GC1、GC2表現(xiàn)為相關(guān)不顯著，而GC1與GC2極顯著相關(guān)。結(jié)果表明，伯樂樹葉綠體基因現(xiàn)役碼第1 和第2 位堿基具有相似的組成，但與第3 位堿基不同。ENCbias值與GC 含量、SL 均無顯著相關(guān)關(guān)系，說明伯樂樹葉綠體基因堿基組成和序列編碼區(qū)長度對碼役偏好并非是主要影響因素。

表1 樣本基因現(xiàn)役碼GC 含量及有效密碼子數(shù)

表2 基因現(xiàn)役碼偏好統(tǒng)計(jì)參量的相關(guān)性分析

2.2 中性繪圖分析

圖1 表明，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.016，雙尾檢驗(yàn)不顯著，直線斜率為0.207 9，GC3與GC12的相關(guān)性很弱，突變對現(xiàn)役碼第3 位堿基組成的影響與第1、2 位不同。說明伯樂樹葉綠體基因碼役偏好的形成受突變影響作用較弱，其它因素尤其是選擇在此過程中可能起到重要的作用。

圖1 中性繪圖

2.3 奇偶偏好繪圖分析

圖2 顯示，大部分樣本基因分布于下方區(qū)域，說明在現(xiàn)役碼第3 位T 的使用頻率高于A，分布于左下方的基因略多于右下方，表明現(xiàn)役碼第3 位堿基C 的使用高于G。由此推測，伯樂樹葉綠體基因碼役模式受突變和選擇壓力等因素的共同影響。

圖2 奇偶偏好繪圖

2.4 有效密碼子數(shù)繪圖分析

圖3 顯示，樣本基因ENCbias值較分散，基因間碼役偏好差別明顯。表3 的RENC頻率分析顯示，大部分樣本基因RENC分布在－0.05～0.10 之間，表明伯樂樹葉綠體中該部分基因的碼役偏好更多受突變的影響。rps14、petD、rps8、rps18 等基因遠(yuǎn)離ENCmuta曲線，位于曲線下方，表明伯樂樹葉綠體中的這些基因受選擇壓力影響較大，碼役偏好較強(qiáng)。

圖3 有效密碼子數(shù)繪圖

表3 RENC頻率分布

2.5 對應(yīng)性分析

主成分分析計(jì)算結(jié)果顯示，第一主分量軸體現(xiàn)9.45%的差異，第二、三、四主分量軸分別為8.32%、7.65%和6.77%。第一軸對樣本基因碼役偏好有較大影響。相關(guān)分析計(jì)算結(jié)果顯示，第一主分量軸與ENCbias、GCall、GC3的相關(guān)系數(shù)分別為－0.208、－0.013、－0.064，且無顯著相關(guān)性，因此GC 含量并非是第一主分量軸的單獨(dú)影響因素。圖4 顯示，樣本基因中遺傳結(jié)構(gòu)基因分布比較集中，表明伯樂樹葉綠體遺傳結(jié)構(gòu)基因的碼役模式相對一致。

2.6 最優(yōu)密碼子分析

圖4 基于RSCU 的對應(yīng)性分析

經(jīng)過計(jì)算，用ΔRSCU ≥0.08 的標(biāo)準(zhǔn)篩選優(yōu)越密碼子，以RSCUall＞1 為高頻密碼子，以同屬二者的現(xiàn)役碼作為最優(yōu)密碼子，結(jié)果見表4。最終確定伯樂樹葉綠體有16 個(gè)最優(yōu)密碼子，其中15個(gè)密碼子以A 或U 結(jié)尾，僅1 個(gè)密碼子以G 結(jié)尾。伯樂樹葉綠體基因中ΔRSCU＞0.5 的密碼子有7個(gè)，分別為GCU、GGU、UUG、CAA、CGU、UCU、ACU。

3 討論

環(huán)境選擇壓力對密碼子第3 位堿基的影響較小，第3 位堿基的變化通常不會改變氨基酸的對應(yīng)關(guān)系，因此，經(jīng)常把GC3作為分析密碼子役傭的重要依據(jù)[13]。分析伯樂樹葉綠體基因顯示，現(xiàn)役密碼子第1、2 位與第3 位堿基組成變異相關(guān)性不顯著，現(xiàn)役密碼子偏好與堿基組成、序列長度均無顯著相關(guān)關(guān)系。奇偶偏好繪圖分析表明，現(xiàn)役密碼子第3 位堿基頻率T＞A，C＞G，嘧啶頻率高于嘌呤。該結(jié)果與陸地棉Gossypium hisutum[14]基本一致，與降香黃檀Dalbergia odorifera[15]、大花香水月季Rosaodorata var.gigantea[16]、馬尾松Pinus massoniana[17]等不盡相同，這或許是物種間差異或統(tǒng)計(jì)方法不同所致。

表4 最優(yōu)密碼子有關(guān)統(tǒng)計(jì)參量

在有效密碼子數(shù)繪圖分析中，ENCmuta曲線代表了密碼子偏好僅受第3 位GC 突變影響時(shí)基因的位置[14]。有效密碼子數(shù)繪圖分析結(jié)果顯示，大部分樣本基因分布于ENCmuta曲線附近，表明伯樂樹葉綠體中大部分基因現(xiàn)役密碼子偏好差異與GC3的差異有關(guān)，主要受到突變影響。結(jié)合堿基組成分析、對應(yīng)性分析等結(jié)果，說明伯樂樹葉綠體基因現(xiàn)役密碼子第3 位GC 含量對密碼子偏好存在一定影響，但并非主要影響因素。伯樂樹葉綠體中仍有15 個(gè)基因，如rps14、petD、rps8、rps18等，分布于ENCexp曲線下方較遠(yuǎn)處，表明伯樂樹葉綠體中這部分基因主要密碼子偏好較強(qiáng)，受選擇壓力的影響較大。

伯樂樹葉綠體基因最優(yōu)密碼子分析劃分了3個(gè)等級，ΔRSCU ≥0.08 有6 個(gè)，ΔRSCU ≥0.3 的有3 個(gè)，ΔRSCU ≥0.5 的有7 個(gè)。共確定出16個(gè)最優(yōu)密碼子，其中15 個(gè)密碼子以A 或T 結(jié)尾。這符合雙子葉植物偏向于役用以A、T 結(jié)尾的密碼子的結(jié)論[15]。

伯樂樹葉綠體基因密碼子偏好更多受到自然選擇等因素的影響，而突變影響較弱。最終結(jié)合高頻密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子，確定GCA、GCU、UGU、GAU、GGU、AUU、AAA、UUA、UUG、CCA、CAA、CGU、UCU、ACU、GUA、GUU 等16個(gè)伯樂樹葉綠體基因最優(yōu)密碼子。本研究為未來伯樂樹葉綠體基因改造及密碼子優(yōu)化等提供了參考。

致謝：承蒙王俊杰先生悉心指導(dǎo)和詳盡建議，本文修改后更加嚴(yán)謹(jǐn)，論述多有新突破。定稿之際，謹(jǐn)致謝忱！