楊麗霞，張厚亮，吳洪章

(1.天津醫(yī)科大學靜海臨床學院免疫科,天津 301600；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192)

丙型肝炎病毒(HCV)為單股正鏈RNA病毒，感染后可引起肝臟炎性反應，約85%的感染會轉(zhuǎn)為慢性[1]。丙型肝炎是全球性的公共衛(wèi)生健康問題，患者人數(shù)眾多。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界約1.7億到2.0億人患丙型肝炎，每年約有39.9萬人因長期HCV感染導致肝硬化或肝癌死亡[2]，我國是HCV感染人數(shù)較多的國家之一，并且丙型肝炎已經(jīng)繼乙型肝炎之后成為我國肝細胞癌的另一個重要致病因素[3]。隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)活性氧自由基(ROS)可引起核酸損傷，而其所引發(fā)的氧化應激是肝細胞損傷的重要環(huán)節(jié)，ROS增多可引起核酸中堿基修飾、錯配、蛋白變異。RNA中鳥嘌呤核苷常在ROS的作用下形成8-氧化鳥苷(8-oxo-Gsn)，受損的核酸氧化產(chǎn)物進入血液循環(huán)，從尿液排出。RNA的氧化損傷可能參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。8-oxo-Gsn是RNA鳥苷的氧化產(chǎn)物，可作為體內(nèi)RNA氧化標志物，在發(fā)生氧化損傷后尿液中的8-oxo-Gsn水平較其他體液指標變化更明顯，其檢測手段具有無創(chuàng)性，容易操作，是極具臨床推廣價值的RNA氧化損傷標志物。本研究旨探討尿液中RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn與丙型肝炎肝損害的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5月至2018年8月在天津醫(yī)科大學靜海臨床學院和天津市第二人民醫(yī)院進行肝穿刺活檢的慢性丙型肝炎(CHC)患者45例作為CHC組，其中男25例、女20例，年齡29～65歲，平均(48.8±11.1)歲；選取同期的HCV攜帶者50例作為HCV攜帶組，其中男28例、女22例，年齡31～63歲，平均(49.3±10.8)歲；選取同期體檢健康者50例作為對照組，其中男25例、女25例，年齡30～63歲，平均(47.9±12.7)歲。各組年齡差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2納入及排除標準

1.2.1CHC組患者 納入標準：CHC患者符合《丙型肝炎防治指南》(2015更新版)[5]CHC診斷標準，即HCV感染6個月以上，或有6個月以前的流行病學史；血清HCV抗體陽性及HCV核糖核酸(HCV RNA)陽性；肝臟組織病理學檢查符合慢性肝炎；或根據(jù)臨床癥狀、體征、實驗室及影像學檢查結果綜合分析診斷。排除標準：酒精性肝炎、脂肪肝；有甲、乙、丁、戊、庚型等其他肝炎病毒的混合感染；人類免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒等感染性疾??；有嚴重心、腦疾病及各種嚴重全身性疾?。唤邮苓^干擾素或抗病毒治療；有穿刺禁忌證。

1.2.2HCV攜帶組 納入標準：HCV抗體陽性，HCV RNA陰性；1年內(nèi)連續(xù)隨訪2次以上，每次間隔6個月，肝功能均正常。排除標準：酒精性肝炎、脂肪肝；有其他肝炎病毒的混合感染；HIV、梅毒等感染性疾?。粐乐匦?、腦疾病及各種嚴重全身性疾病。

1.2.3對照組 納入標準：體檢身體健康。無酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝??；無甲、乙、丁、戊、庚型等其他肝炎病毒的混合感染；無HIV、梅毒等感染性疾?。惑w檢肝、腎功能等各項常規(guī)檢測項目均無異常。

1.3儀器與試劑 Agilent UPLC 1290超高效液相系統(tǒng)(Agilent公司,美國)；Agilent 6490 Triple Quad MS/MS三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)連用系統(tǒng)(Agilent公司,美國)。液相條件如下。A液：10 mmol/L醋酸銨水溶液,調(diào)節(jié)pH值3.7；B液：色譜級純甲醇；色譜柱:SB-Aq，3.0 mm×100.0 mm，1.8 μm，600 Bar(Agilent公司，美國)，柱溫35 ℃。羅氏Cobas c701全自動生化分析儀及其配套試劑。

1.4方法

1.4.1檢測方法 留取納入研究者空腹新鮮中段晨尿,裝入15 mL無菌尿管，立即于-80 ℃冰箱凍存。應用同位素稀釋高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(ID-LC-MS/MS)定量測定所有患者晨尿中8-oxo-Gsn水平，酶法測定尿肌酐值(creatinine)。尿液的前處理：凍存的尿液于37 ℃水浴10 min解凍，7 500×g，離心5 min(4 ℃)；取上清200 μL，200 μL工作液(70%純甲醇,30%醋酸銨水溶液,水平10 mmol/L，pH值為3.7),再加入10 μL濃度為480 pg/μL的8-oxo-Gsn(13C,15N2)同位素內(nèi)標,震蕩混勻2 min,置于37 ℃溫育箱孵育10 min，然后12 000×g低溫離心15 min(4 ℃),上清液用作LC-MS/MS檢測分析，試驗嚴格按照產(chǎn)品說明和儀器操作規(guī)程進行。用尿creatinine校正測得的8-oxo-Gsn值以減少腎小球功能和尿液體積對測定的影響，校正方法參考文獻[6]。C校正=C測定/C尿creatinine，合格creatinine水平范圍0.5～3.0 g/L。

1.4.2肝臟組織學檢查 通過超聲檢查定位,取右腋中線第8～9肋間隙、肝實音處為穿刺點,囑患者深吸氣屏氣，采用美國Bard公司生產(chǎn)的彈射式肝穿刺槍和配套的16 G一次性活檢穿刺針，1 s負壓吸取肝組織,要求穿刺取出的肝組織長度≥1.5 cm,包含至少3個可供評價匯管區(qū)。常規(guī)用10%甲醛溶液固定肝組織，及時送檢。使用國際上最常用的肝纖維化METAVIR評分系統(tǒng)[7]，將肝組織纖維化程度分為0～4五個等級：F0為無纖維化；F1為匯管區(qū)星芒狀擴大但無纖維間隔形成；F2為匯管區(qū)星芒狀擴大，極少數(shù)纖維間隔形成；F3為眾多纖維間隔，但無硬化；F4為硬化。將肝組織炎癥活動度分為0～3四個等級：A0為無活動，A1為輕度活動，A2為中度活動，A3為重度活動。

2 結 果

2.1尿液8-oxo-Gsn水平的比較 CHC組尿8-oxo-Gsn水平顯著高于HCV攜帶組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.319,P=0.002)；HCV攜帶組尿8-oxo-Gsn水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.867,P=0.000)，見表1。

表1 各組間尿8-oxo-Gsn水平比較

2.2CHC患者各組間尿8-oxo-Gsn、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平比較 肝臟炎癥程度高(A2～A3)的患者尿液8-oxo-Gsn、血清ALT、AST水平均顯著高于肝臟炎癥程度低(A0～A1)的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。纖維化程度高(F3～F4)的患者尿8-oxo-Gsn水平與纖維化程度低(F0～F2) 的患者比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。尿8-oxo-Gsn水平與血清ALT和AST并未發(fā)現(xiàn)相關性(P分別為0.212、0.470)。不同炎癥分期及纖維化分期的CHC患者間檢測指標的比較見表2。

表2 CHC各組間尿8-oxo-Gsn、血清ALT、AST水平比較

2.3ROC分析8-oxo-Gsn對CHC炎癥活動度和纖維化程度的診斷價值 8-oxo-Gsn對CHC炎癥活動度的診斷靈敏度為82.2%，特異度為75.3%，曲線下面積(AUC)為0.812；8-oxo-Gsn對CHC纖維化程度的診斷靈敏度為83.2%，特異度為77.3%，AUC為0.822。見圖1。

注：A為8-oxo-Gsn對CHC炎癥活動度診斷的ROC曲線；B為8-oxo-Gsn對CHC纖維化程度診斷的ROC曲線。

圖18-oxo-Gsn用于診斷的ROC曲線

3 討 論

HCV感染是急性丙型肝炎或CHC、肝硬化和肝癌的病因之一。在感染早期，大部分患者沒有任何癥狀，HCV也是導致肝臟損傷的直接原因之一，病毒感染可引起核酸損傷，而其所引發(fā)的氧化應激是肝細胞損傷的重要環(huán)節(jié)，造成ROS釋放增多，使吞噬細胞活化并釋放前氧化性細胞因子,ROS由其羥基自由基進一步損傷核酸，引發(fā)蛋白質(zhì)變異造成肝臟病變[8]。目前丙型肝炎肝損害程度的評估及是否進行抗病毒治療主要依靠一般血液生化檢測、影像學和病理學檢查。然而有證據(jù)顯示，有部分ALT正常的CHC患者肝穿刺組織病理學呈明顯肝損傷表現(xiàn)，如不早期臨床干預會增加肝硬化甚至肝癌的發(fā)生風險。由于肝穿刺檢測周期長、成本高，給患者造成有創(chuàng)傷害，不易推廣應用，影響了隱匿性HCV感染患者肝組織損害狀態(tài)的評估，影像學檢查有一定的漏診率和灰區(qū)[9]。根據(jù)丙型肝炎防治指南，即便是對肝纖維化評估較為理想的FibroScand對肝損傷判定也存在一定的灰區(qū)[10]。無創(chuàng)性檢測方法對于醫(yī)生判斷患者肝臟炎癥分期是非常重要的檢測手段之一，并對提高患者治療依從性有一定幫助。研究表明，晨尿中RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn用creatinine校正后，與24 h尿中RNA氧化產(chǎn)物濃度意義相近，能反映一定時間內(nèi)人體氧化應激水平[11]。

氧化應激是人體正常細胞中氧化和抗氧化失去平衡的一種狀態(tài)，在引起肝臟發(fā)生病理損傷中發(fā)揮了關鍵作用[12]。當前許多研究證明RNA在細胞質(zhì)中分布廣泛，相對于DNA來說，RNA大部分為單鏈，缺乏組蛋白保護和RNA聚合酶的校正功能，容易受到ROS攻擊發(fā)生氧化損傷，氧化修飾的RNA可引起轉(zhuǎn)錄翻譯的異常，從而導致蛋白質(zhì)合成的障礙，誘發(fā)細胞變異[13]，RNA中鳥嘌呤核苷常在ROS的作用下形成氧化代謝產(chǎn)物8-oxo-Gsn。分泌至血液、尿液、腦脊液等體液中的氧化代謝產(chǎn)物8-oxo-Gsn可作為一種新的生物學標志物，提示體內(nèi)RNA氧化損傷的水平，對人們了解疾病狀態(tài)、致病因素、治療選擇等有一定的參考價值。WANG等[14]在糖尿病的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)也證實了這一點，高血糖狀態(tài)下相較于DNA，RNA更易受到損傷。有研究表明,RNA氧化損傷是一種潛在的發(fā)病機制，氧化損傷在一些疾病及并發(fā)癥的發(fā)生和進展中扮演了重要角色[15]。RNA氧化參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，如氧化應激相關疾病、糖尿病、腫瘤等。LIU等[6]運用ID-LC-MS/MS法檢測對比糖尿病患者及健康人尿8-oxo-Gsn后發(fā)現(xiàn)，尿8-oxo-Gsn的升高可能是一種糖尿病進展的危險因素，尤其在糖尿病合并大血管病變中RNA氧化損傷與許多疾病相關，是許多疾病的潛在發(fā)病機制，尤其是神經(jīng)退行性病變、糖尿病等疾病。SONG等[16]研究證明在胃癌患者尿8-oxo-Gsn顯著增高,與胃癌分期嚴重程度有明顯相關性。RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn已經(jīng)成為公認的RNA氧化最重要的標志物，前期研究表明，在大鼠和獼猴等動物組織和體液中，如白細胞、血液和尿液中，RNA氧化產(chǎn)物8-oxo-Gsn水平隨年齡逐漸升高，且尿液中的8-oxo-Gsn水平最高[17-20]。因此，無創(chuàng)性尿液8-oxo-Gsn是一種評估機體氧化應激損傷非常重要的生物學標志物。

RNA氧化標志物的檢測目前主要采用免疫組化法、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)、高效液相色譜-電化學探測器聯(lián)用法(HPLC-ECD)及ID-LC-MS/MS,有研究認為ID-LC-MS/MS是最具有靈敏度和特異度的檢測尿液8-oxo-Gsn的方法，推薦使用ID-LC-MS/MS檢測尿液8-oxo-Gsn評估患者氧化應激損傷情況[7]。本研究采用無創(chuàng)的ID-LC-MS/MS檢測尿液中RNA氧化標志物8-oxo-Gsn，結果顯示CHC組尿液中RNA氧化標志物8-oxo-Gsn顯著高于HCV攜帶組，HCV攜帶組患者尿8-oxo-Gsn顯著高于對照組，尿液8-oxo-Gsn水平對快速判斷丙型肝炎患者所處感染的不同臨床時期有重要參考價值，可用于區(qū)分丙型肝炎攜帶者和CHC患者。肝臟炎性損傷程度越高尿8-oxo-Gsn水平越高，說明尿液8-oxo-Gsn對評估丙型肝炎炎癥程度有較高的參考價值。血清ALT和AST與丙型肝炎炎癥程度顯著相關。纖維化程度高的患者尿8-oxo-Gsn水平也高于纖維化程度低的患者,但差異無統(tǒng)計學意義，是否受標本例數(shù)的影響，下一步本課題組還將深入研究。

4 結 論

8-oxo-Gsn作為一種極具潛力的新型氧化損傷標志物，對評估丙型肝炎肝臟損害程度有較高的價值，對臨床選擇治療方案提供一定的依據(jù)。尿液8-oxo-Gsn有可能對于患者抗病毒療效觀察起到一定輔助作用，由于本研究樣本量少，數(shù)據(jù)分析受多種因素干擾可能存在偏移，后續(xù)本課題組將進一步深入研究以減少這類偏移。