楊婉瑩 孫莎莎 鞏 彪 李曉彤 劉 越 史慶華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海設(shè)施

農(nóng)業(yè)工程科學(xué)觀測實驗站,山東泰安 271018)

鎘(Cd)是土壤污染的主要重金屬之一,極易被植物吸收,并積累在可食用部位,通過食物鏈危害人體健康[1]。雖然鎘不具有氧化還原活性,不能直接產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),但鎘毒害能夠引起植物體內(nèi)活性氧的爆發(fā),過量的活性氧會引起細胞膜解體、離子滲漏、脂質(zhì)過氧化和核酸降解,最終導(dǎo)致細胞死亡[2]。此外,鎘還可以與富含巰基的多肽結(jié)合,形成鎘-配體復(fù)合物,消耗具有還原活性的多肽[3]。為了應(yīng)對脅迫,植物本身進化出一套酶促和非酶促的抗氧化系統(tǒng)來清除和平衡體內(nèi)的活性氧,包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(guaiacol peroxidase,POD)、抗壞血酸氧化酶(ascorbate peroxidase,APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)等抗氧化酶類,以及抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)等抗氧化物質(zhì)。抗氧化能力的增強是植物適應(yīng)重金屬脅迫的重要生理途徑。

硫代腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-Lmethionine synthetase,SAMS)催化硫代腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)的合成。SAM是重要的甲基供體,又是多胺和乙烯等多種物質(zhì)合成的前體[4]。最早發(fā)現(xiàn)番茄中的SAMS基因參與鹽脅迫響應(yīng),且在玉米中SAMS2和SAMS4 也明顯受鹽脅迫誘導(dǎo)[5-6]。研究表明,過量表達SAMS可以提高植物抵抗非生物脅迫的能力,Ezaki 等[7]在擬南芥中超表達AvSAMS1,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能夠抵抗鋁脅迫,推測其機理可能是過表達該基因?qū)е铝艘吧秃娃D(zhuǎn)基因植株間不同的DNA和組蛋白H3 甲基化狀態(tài)的變化。Gong等[8]和Guo 等[9]分別在番茄和苜蓿中超表達SAMS1基因,發(fā)現(xiàn)SAMS1可以通過上調(diào)多胺合成及氧化,進而激發(fā)H2O2誘導(dǎo)的抗氧化保護系統(tǒng),提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽堿和低溫的抗性。Singh 等[10]通過給鎘中毒的大鼠服用SAM,提高了大鼠體內(nèi)SOD活性和GSH含量,進而緩解了鎘誘發(fā)的肝損傷。由此可見,SAMS1基因可能在調(diào)控生物的廣譜抗性中發(fā)揮重要的作用,但關(guān)于SAMS1 緩解番茄鎘脅迫的研究鮮見報道。因此,本研究擬利用超表達SlSAMS1 番茄植株[8],比較轉(zhuǎn)基因和野生型番茄植株耐鎘性差異,并進一步研究抗氧化系統(tǒng)的變化,以期為豐富SAMS1的生理功能和提高植物的耐鎘能力奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料培及試驗設(shè)計

試驗材料為895 自交系的野生型番茄(Solanum lycopersicumL.)和超表達SlSAMS1 植株的3個獨立株系:SAMS1-3、SAMS1-7、SAMS1-11[8]。

試驗于2018年3-5月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代化玻璃溫室內(nèi)進行。番茄種子在28℃超純水中浸種7 h后,于28℃恒溫箱中催芽,待種子露白后播于裝有育苗基質(zhì)(草炭∶蛭石=3∶1)的穴盤中。適時澆灌1/2 Hogland 營養(yǎng)液。待番茄長至兩葉一心時,挑選整齊一致的幼苗,采用Hogland 營養(yǎng)液(1倍)水培法,將其培養(yǎng)于5 L的黑色塑料盒內(nèi),用白色泡沫板使幼苗地上部浮于液面上,每盆4 棵,待幼苗四葉一心時,以CdCl2·H2O為鎘來源添加到營養(yǎng)液中,鎘濃度為50 μmol·L-1,分別取鎘處理0、3、6、12、24、48 h的野生型番茄根和葉片進行SlSAMS1的定量分析;處理12 d后,取番茄葉片和根系進行各項指標(biāo)的測定。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葉片葉綠素含量測定 參照趙世杰等[11]的方法。取0.2 g 鮮樣,加入20 mL 80%丙酮,置于暗處24～36 h,然后分別于663.3、646.8、470 nm 波長下進行比色。

1.2.2 鎘含量測定 參考馮世靜等[12]方法。鎘處理12 d后,分別取野生型和轉(zhuǎn)基因番茄幼苗,用去離子水沖洗干凈,然后將根浸入10 mmol·L-1EDTA-Na2溶液中交換30 min,用吸水紙吸干表面水分,將植株分為根、莖、葉,并于105℃殺青30 min,再于75℃烘干至恒重。植株各器官中的鎘含量采用NexION 300X 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(PerkinElmer,美國)測定。將烘干的植株樣品用粉碎機粉碎過100目篩后,稱取0.3 g 于聚四氟乙烯灌中,然后加入5 mL 濃硝酸,放置過夜,再加入2 mL 30%過氧化氫,隨后置于微波消解爐中消解,消解完成后定容至50 mL。采用0.22 μm 水系濾膜過濾后,上機測定。

H2O2含量測定參照Dhindsa 等[14]方法。鎘處理12 d后,取0.5 g 番茄葉片,加入4 mL 預(yù)冷丙酮研磨成勻漿,4℃條件下10 000×g離心20 min,保留上清液。取1 mL 上清液,加入2 mL 萃取劑[CCl4∶CH3Cl3=3∶1]混勻,再加入3 mL 蒸餾水,4℃條件下6 000×g離心2 min,保留上層水相。取1 mL 上層水相為待測液,分別加入0.1 mL 20% TiCl4-濃HCl 溶液和0.2 mL 濃氨水,待沉淀形成后,于4℃條件下6 000×g離心12 min,棄上清液,向沉淀中加入5 mL 2 mol·L-1H2SO4完全溶解后,于410 nm 波長下進行比色。

1.2.4 丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量測定 參考Dhindsa 等[14]的方法。取0.3 g 番茄葉片,加入3 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8,含0.2 mmol·L-1EDTA)研磨成勻漿,12 000 r·min-1離心20 min,保留上清液。取1 mL 上清液,加入3 mL 三氯乙酸(trichloroacetil acid,TCA)反應(yīng)液,混勻后于95℃水浴30 min,然后立即冷卻,1 500 r·min-1離心10 min,上清液分別于532、600、450 nm 波長下進行比色。

1.2.5 過氧化物酶活性測定 SOD、CAT、POD、APX活性測定參照Shalata 等[15]的方法。酶的提取:取0.3 g 番茄葉片,加入3 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.8,含0.2 mmol·L-1EDTA;測定APX時,加入AsA溶液)研磨成勻漿,4℃條件下12 000 r·min-1離心20 min,上清液即為酶的粗提液。酶活的測定:SOD 反應(yīng)液為NBT 反應(yīng)液,測定時取50 μL 提取液與3 mL 反應(yīng)液混合,25℃下光照15 min后于560 nm 波長下進行比色;CAT、POD、APX的反應(yīng)混合液為25 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值7.0)和H2O2,在POD和APX的反應(yīng)液中分別加入1%愈創(chuàng)木酚和5 mmol·L-1AsA,最后加入100 μL 提取液,分別于240、470、290 nm 波長下進行動力學(xué)測定。

GR活性測定參照Chaoui 等[16]的方法。酶的提取:取0.5 g 番茄葉片,加入4 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH值7.0,含AsA、EDTA、GSH 各1 mmol·L-1以及5 mmol·L-1MgCl2) 研磨成勻漿,4℃條件下20 000 r·min-1離心30 min,上清液即為酶的粗提液。酶活的測定:取100 μL 提取液加入3 mL 反應(yīng)液[50 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.5)、5 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)和0.2 mmol·L-1NADPH]后立即于340 nm 波長下進行動力學(xué)測定。

脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)活性測定參照Pinto 等[17]的方法。酶的提取:取0.5 g 番茄葉片,加入4 mL 50 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.8,含2 mmol·L-1AsA和0.2 mmol·L-1EDTA)研磨成勻漿,4℃條件下12 000×g離心20 min,上清液即為酶的粗提液。酶活的測定:取100 μL 提取液,加入3 mL 反應(yīng)液[25 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.0)、0.2 mmol·L-1EDTA、70 mmol·L-1GSH和0.1 mmol·L-1脫氫抗壞血酸(dehydroascorbic acid,DHA)]后混勻立即于265 nm 波長下進行動力學(xué)測定。

1.2.6 抗壞血酸和谷胱甘肽含量的測定 參照李忠光等[18]的方法。取0.5 g 番茄葉片鮮樣,加入2.5 mL 預(yù)冷的5%磺基水楊酸,充分研磨后4℃下20 000×g離心20 min,上清液即為提取液。在酸性條件下,AsA可將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與雙吡啶形成紅色絡(luò)合物,此絡(luò)合物在525 nm 波長處有最大吸收峰,以此測定樣品中的AsA、DHA含量。1 mol GSH可與1 mol 2-硝基苯甲酸[5,5’-Dithiobic-(2-nitrobenzoic acid) DTNB]反應(yīng)形成1 mol 硝基苯甲酸,此物質(zhì)在412 nm 波長處有最高吸收峰,以此測定GSH、GSSG含量。

1.2.7 熒光定量分析 參照Kenneth 等[19]的方法。采用Trizol提取番茄葉片和根系的總RNA,反轉(zhuǎn)錄使用HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR(+g DNA wiper)(VazymmeTM)試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板,采 用 Power SYBR Green PCR Master Mix(TransGen Biotech)進行實時熒光定量。內(nèi)參基因和SlSAMS1基因的熒光定量PCR 引物分別為actin-F:GA AGCACCTCTCAACCCTAAG;actin-R:GCATACAAGGA AAGCACAGC;SlSAMS1-F:CAGTTCTTGATGCCTGCCT T;SlSAMS1-R:CGTGGACACCTTGAGCAAT。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010軟件整理試驗數(shù)據(jù),應(yīng)用Origin Pro 2017軟件繪制圖表,并用SPSS 17軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫誘導(dǎo)SlSAMS1的表達

為了確定SlSAMS1是否響應(yīng)鎘脅迫,對50 μmol·L-1鎘處理48 h 內(nèi)番茄幼苗的根和葉中SlSAMS1的表達進行了分析。由圖1可知,鎘誘導(dǎo)根中SlSAMS1表達量顯著上調(diào),脅迫24 h時,達到峰值,為對照(鎘處理時間為0 h)的2.4倍;葉片中SlSAMS1雖然也受到鎘的誘導(dǎo),但響應(yīng)緩慢,其表達量略有上調(diào),總體呈上升趨勢。50 μmol·L-1CdCl2顯著誘導(dǎo)了番茄植株中SlSAMS1的表達,且根中響應(yīng)更為迅速,而葉片響應(yīng)較慢,且上調(diào)幅度較小,可能是因為根是直接接觸鎘的部位,根的截留作用使得運往地上部的鎘含量遠低于根中。

圖1 SlSAMS1基因在50 μmol·L-1鎘脅迫下的表達分析Fig.1 The expression analysis of SlSAMS1 gene under 50 μmol·L-1 cadmium stress

2.2 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗生長及葉片葉綠素含量的影響

植株矮小,葉片黃化是植物鎘中毒的常見癥狀。由表1可知,超表達SlSAMS1顯著緩解鎘脅迫對番茄植株生長的抑制,但不同株系間存在一定的差異。與未經(jīng)鎘處理的野生型番茄相比,鎘處理下野生型番茄的株高、莖粗、地上部鮮重和根部鮮重分別下降了29.0%、30.8%、66.7%、37.2%。由表2可知,鎘脅迫顯著降低了野生型番茄和3個獨立株系番茄葉片中的葉綠素含量,但在相同濃度鎘處理下,超表達SlSAMS1番茄的葉綠素含量顯著高于野生型。以上結(jié)果表明,超表達SlSAMS1 能顯著緩解鎘脅迫引起的植株生長受抑以及葉片黃化的狀況。

表1 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗生長的影響Table1 Effect of overexpressing SlSAMS1 on the growth of tomato seedlings under cadmium stress

表2 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗葉綠素含量的影響Table2 Effect of overexpressing SlSAMS1 on the chlorophyll content of tomato seedlings under cadmium stress

2.3 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄葉片中的ROS 積累和MDA含量的影響

鎘脅迫打破了植物ROS的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的平衡,導(dǎo)致ROS 過度積累,進而引發(fā)膜脂過氧化。MDA含量反映了膜脂過氧化程度。由圖2可知,鎘脅迫下,野生型番茄和3個獨立株系番茄葉片的產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA含量都顯著升高,且3個獨立株系番茄的產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量均顯著低于野生型番茄。綜上表明,SlSAMS1基因可以降低鎘脅迫下ROS的積累和膜脂過氧化水平。

2.4 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄抗氧化酶活性的影響

由圖3可知,未經(jīng)鎘處理時,野生型番茄的抗氧化酶活性與3個獨立株系番茄間差異較小,而鎘處理導(dǎo)致番茄葉片中SOD、POD活性顯著升高,并且超表達SlSAMS1顯著提高了鎘脅迫下番茄葉片中POD活性而SOD活性受SlSAMS1 影響較小。野生型番茄的CAT、APX、DHAR、GR活性受鎘脅迫影響保持不變甚至顯著下降,而與野生型比較,超表達SlSAMS1顯著提高了鎘脅迫下番茄葉片中CAT、APX、GR活性。上述結(jié)果表明,SlSAMS1基因可以提高鎘脅迫下抗氧化酶的活性,緩解鎘引起的氧化傷害。

圖2 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗活性氧積累及MDA含量的影響Fig.2 Effect of overexpressing SlSAMS1 on ROS accumulation and MDA content in tomato seedlings under cadmium stress

2.5 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄葉片AsA和GSH含量的影響

由圖4可知,鎘脅迫導(dǎo)致番茄葉片中AsA含量顯著降低,而顯著提高了GSH含量;超表達SlSAMS1 使鎘脅迫下番茄葉片中AsA和GSH含量均顯著高于野生型番茄。DHA和GSSG 作為AsA和GSH的氧化產(chǎn)物,在鎘脅迫下各番茄中的DHA和GSSG含量均上升,尤其在野生型番茄中的積累量增加更加顯著。AsA/DHA、GSH/GSSG 反映了植物內(nèi)環(huán)境的氧化還原狀態(tài)。鎘脅迫下,野生型番茄的AsA/DHA和GSH/GSSG 比值均顯著降低,超表達SlSAMS1 使AsA/DHA和GSH/GSSG 均較野生型番茄有不同程度的提高。AsA、GSH是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì),可以清除ROS,維持植物體內(nèi)環(huán)境的氧化還原平衡,表明SlSAMS1基因可以提高鎘脅迫下AsA、GSH含量以及AsA/DHA、GSH/GSSG 比值,提高番茄的抗氧化水平,緩解鎘脅迫。

2.6 超表達SlSAMS1對番茄植株鎘積累的影響

由圖5可知,鎘處理12 d后鎘在番茄植株中積累量根中最高,其次為葉片和莖。超表達SlSAMS1 番茄莖和葉中鎘含量與野生型番茄相比無顯著差異,但根中鎘的積累量顯著低于野生型番茄。上述結(jié)果表明,SlSAMS1 降低了鎘在根中的積累。

3 討論

SAMS 蛋白在鎘脅迫下顯著上調(diào),可能與SAM可作為GSH的合成前體有關(guān)[20-22]。本研究為了證明SlSAMS1 參與調(diào)控番茄對鎘脅迫的適應(yīng)性,以前期獲得的超表達SlSAMS1 番茄為試驗材料,發(fā)現(xiàn)超表達SlSAMS1可以顯著緩解鎘脅迫誘導(dǎo)的葉片失綠和生長受抑狀況。SAMS1 編碼植物中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶,該酶的產(chǎn)物SAM是多胺的合成前體。研究表明,在番茄和苜蓿中超表達SAMS1基因可以提高植株中多胺的含量[8-9]。多胺作為植物體中生物活性較強的低分子脂肪族含氮堿廣泛參與植物對逆境脅迫抗性的調(diào)節(jié)[23-25];在緩解重金屬脅迫方面,多胺可以充當(dāng)抗氧化物質(zhì)及增強抗氧化系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑,在一定程度上緩解植物組織因受重金屬脅迫引起的氧化損傷[26-27]。因此,超表達SlSAMS1 植株可能通過多胺途徑清除活性氧。本研究結(jié)果表明,與野生型番茄相比,3個獨立株系番茄在鎘脅迫下ROS和MDA水平顯著降低,這可能是SlSAMS1 提高番茄耐鎘的重要機理之一。

圖3 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of overexpressing SlSAMS1 on the activity of antioxidant enzymes in tomato seedlings under cadmium stress

當(dāng)鎘進入植物細胞后,因其對硫醇基團的高親和性,迅速結(jié)合了大量的GSH,從而消耗了GSH。GSH不僅是螯合肽的前體,同時也是一種非常重要的抗氧化劑,可以直接清除ROS 或者通過AsA-GSH 循環(huán)清除H2O2,維持內(nèi)環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)[28-29]。本試驗結(jié)果表明,鎘脅迫下3個獨立株系番茄中的GSH含量顯著高于野生型番茄,這可能是因為超表達SlSAMS1基因促進了SAM的合成,而SAM 作為GSH的合成前體,促進了GSH的積累。同時,鎘脅迫下3個獨立株系番茄的GR活性也顯著高于野生型番茄,促進了GSSG 向GSH的轉(zhuǎn)化,維持了細胞內(nèi)的較高的GSH水平。AsA-GSH 循環(huán)的另一個重要抗氧化劑AsA 在抵御非生物脅迫方面也發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),AsA含量少的植物對鹽脅迫更加敏感[30],且不同于脅迫下GSH的變化,長時間的鎘脅迫會導(dǎo)致AsA水平的顯著降低[31-32]。本研究中,鎘脅迫12 d后,番茄中AsA含量顯著下降,但相對于野生型番茄,3個獨立株系番茄依然維持了較高的AsA水平,這可能是因為DHAR活性維持在較高的水平,其中SAMS1-3活性同野生型一致,可能是酶活測定試驗誤差造成的。在AsA-GSH 循環(huán)中,GSH/GSSG、AsA/DHA 比值代表清除H2O2的能力[33]。通常,隨著鎘脅迫時間的延長,GSH/GSSG、AsA/DHA 呈現(xiàn)下降趨勢[34]。而本試驗中,3個獨立株系番茄在鎘脅迫下的GSH/GSSG 都有所提高,這可能是由于SlSAMS1基因誘導(dǎo)鎘脅迫下GR活性的上升,使得在GSH 庫(GSH pool)快速消耗的同時,GR 利用NADPH 提供的氫(H)將其還原成GSH,進而參與了下一次循環(huán)。AsA 在APX的催化下將H2O2還原成H2O,生成的DHA 以GSH為電子供體在DHAR 催化下還原成AsA。在該過程中僅DHAR的活性受鎘毒害后下降,使得DHA 還原受阻。此外,SlSAMS1基因誘導(dǎo)脅迫下番茄POD和CAT活性的升高,增強了獨立株系番茄中對鎘脅迫引起的H2O2的清除能力。

圖4 超表達SlSAMS1對鎘脅迫下番茄幼苗AsA和GSH含量的影響Fig.4 Effect of overexpressing SlSAMS1 on AsA and GSH content in tomato seedlings under cadmium stress

圖5 超表達SlSAMS1對番茄幼苗鎘積累的影響Fig.5 Effect of overexpressing SlSAMS1 on cadmium accumulation in tomato seedlings

當(dāng)植物暴露在含鎘環(huán)境中時,植物細胞有一系列機制抵御鎘毒害。首先,細胞壁阻止鎘進入和傷害原生質(zhì)體,果膠的甲脂化及次生壁的木質(zhì)化都起到了截留鎘的作用,以至于大部分的鎘都留在根中[35-36]。本試驗也得出類似的結(jié)論,根中的鎘含量顯著高于地上部含量。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),獨立株系番茄鎘含量的降低僅發(fā)生在根中,這可能是由于SAMS1基因加速了鎘脅迫下根的木質(zhì)化,阻礙了根對鎘的吸收,該觀點也得到了許多研究的支持,Li 等[37]和Sánchez-Aguayo等[38]分別在石蒜和番茄中發(fā)現(xiàn),鹽脅迫促進SAMS表達上調(diào),且加速了細胞壁的木質(zhì)化,提高了植物的抗鹽能力。此外,在擬南芥mto3 突變體中,SAM含量及其合成酶活性下降,導(dǎo)致木質(zhì)素含量顯著降低了22%[39]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,在鎘脅迫下,超表達SlSAMS1 番茄的株高、莖粗及鮮重都顯著高于野生型番茄,葉綠素含量也較野生型番茄顯著提高。超表達SlSAMS1 提高了番茄AsA-GSH 循環(huán)效率,增強了抗氧化能力,降低了ROS和MDA水平,從而緩解了鎘對番茄植株的脅迫。此外,超表達SlSAMS1 番茄根中的鎘積累量也顯著降低,降低了鎘對根造成的脅迫。由于SAM的功能廣泛,關(guān)于SlSAMS1 緩解番茄鎘脅迫的生理機制還有待進一步研究。