鄒凱茜 楊 衍 田麗波 商 桑 曾麗萍郭雪松 劉子記 朱國鵬

(1 海南大學(xué)園藝學(xué)院/海南省熱帶園藝作物品質(zhì)調(diào)控重點實驗室,海南 ?？?570228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點開放實驗室,海南儋州 571737)

不結(jié)球白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino.)又稱小白菜、青菜、油菜,屬十字花科蕓臺屬,原產(chǎn)于我國長江中下游地區(qū),品種資源豐富[1]。青梗不結(jié)球白菜是一種速生蔬菜,復(fù)種指數(shù)大,一年四季均可種植,非常適于保護地周年生產(chǎn),在全國各地均有栽培,其種植面積約占蔬菜種植總面積的30%,主要集中在長江流域其及以南地區(qū)。青梗不結(jié)球白菜以其清爽的口感和豐富的營養(yǎng)價值,深受廣大消費者青睞[2-4]。在海南等華南地區(qū),人們在炎熱季節(jié)更喜食綠葉蔬菜,但夏秋高溫往往是葉用蔬菜生產(chǎn)的制約性因素,本地生產(chǎn)綠葉蔬菜不能滿足市場需求,常采取異地供應(yīng)措施,大幅度提升了蔬菜成本,導(dǎo)致菜價高昂。熱脅迫也已成為限制全球蔬菜產(chǎn)量的一個重要因素[5-6],因此,研究不結(jié)球白菜耐熱機制,選育耐熱性強的不結(jié)球白菜對于解決高溫季節(jié)蔬菜供應(yīng)問題具有現(xiàn)實意義。

耐熱相關(guān)生理研究中,對抗氧化物質(zhì)有大量報道,胡俏強[7]和陳以博等[8]從生理生化角度對不同耐熱性的不結(jié)球白菜進行了耐熱性鑒定,發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(polyphenol oxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdenhyde,MDA)含量與電導(dǎo)率可作為耐熱鑒定指標。Fujita 等[9]發(fā)現(xiàn)甘藍的POD 在38℃熱激下仍能保持較高活性;吳國勝等[10]對大白菜的研究表明,高溫導(dǎo)致其POD活性降低,CAT活性升高,耐熱性強的大白菜品種POD活性高于耐熱性弱的品種,且SOD活性在高溫下也較為穩(wěn)定;葉陳亮等[11]在大白菜耐熱研究中提出,耐熱品種的SOD、CAT和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性上升,熱敏品種SOD和APX活性均下降。由此可見,抗氧化物質(zhì)在植物與熱脅迫之間扮演著重要角色。

植物對高溫的響應(yīng)是敏感復(fù)雜的,涉及基因型、發(fā)育階段、生理生化、外部環(huán)境等多個層次,選擇合適的耐熱品種的篩選與鑒定方法能極大提高篩選效率。多元統(tǒng)計法目前已廣泛應(yīng)用于黑麥草[12]、葡萄砧木[13]、辣椒[14]和偃麥草[15]等植物的抗逆性綜合評價,而對于青梗不結(jié)球白菜的評價鮮見報道。利用主成分分析并結(jié)合隸屬函數(shù)、計算綜合評價D值的方法能夠?qū)Ρ姸嘀笜诉M行降維,減少后期聚類的計算量,避免主觀決斷。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,采用多元統(tǒng)計方法對高溫脅迫下19個青梗不結(jié)球白菜品種幼苗的抗氧化相關(guān)指標進行綜合分析,客觀全面地評價各品種幼苗的耐熱性,篩選出耐熱性相對優(yōu)良的青梗不結(jié)球白菜品種,并基于各指標與耐熱性之間的關(guān)系建立不結(jié)球白菜耐熱性評價的數(shù)學(xué)模型,以期為不結(jié)球白菜耐熱性資源發(fā)掘和品種選育提供科學(xué)準確的評價體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用19份青梗不結(jié)球白菜種子資源詳見表1。

表1 供試種子Table1 Seeds used in this study

1.2 試驗方法

選取上述19份青梗不結(jié)球白菜品種的種子各140粒,55℃溫湯浸種,適溫催芽,60%露白時播種于基質(zhì)體積比為泥炭∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1的50 孔(1粒/孔)育苗穴盤,常規(guī)管理。當(dāng)幼苗長至4～5 片真葉時,選取長勢一致的幼苗置于人工氣候箱均先按表2預(yù)處理方式進行處理,再分為兩組,分別進行對照處理和正式處理,每處理3 次重復(fù),每個重復(fù)18株,按完全隨機區(qū)組排列。處理完成后,每個重復(fù)隨機選取10株,根據(jù)全株葉片反卷及褪綠情況調(diào)查熱害等級;每個重復(fù)隨機選取植株第2和第3 片真葉剪碎并混勻稱取目標質(zhì)量,最后進行各項指標的測定。

表2 試驗處理條件Table2 Conditions of experimental processing

1.3 測定項目及方法

熱害指數(shù)(heating-injury index,HII)的測定參考劉維信等[16]和胡俏強等[17]的方法。每天對植株進行觀察,根據(jù)葉片反卷及褪綠,統(tǒng)計葉片受害數(shù)量,再進行分級:0級:無熱害癥狀,植株正常;1級:植株受害葉片數(shù)＜全株葉片數(shù)的1/3;3級:全株葉片數(shù)的1/3≤植株受害葉片數(shù)＜全株葉片數(shù)的1/2;5級:全株葉片數(shù)的1/2≤植株受害葉片數(shù)＜全株葉片數(shù)的2/3;7級:植株受害葉片數(shù)≥全株葉片數(shù)的2/3 或植株失去經(jīng)濟價值。按照公式計算熱害指數(shù):

熱害指數(shù)=∑(各級株數(shù)×級數(shù))/(最高級數(shù)×調(diào)查總株數(shù))×100% (1)。

根據(jù)熱害指數(shù),將19個不結(jié)球白菜品種按照耐熱性進行分類:≥91%為極弱,81%≤極弱至弱＜91%,69%≤弱＜81%,57≤弱至中＜69%,45%≤中＜57%,33%≤中至強＜45%,21%≤強＜33%,11%≤強至極強＜21%,0≤極強＜11%。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸顯色法;抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量測定采用二氯靛酚滴定法;POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法;CAT活性測定采用紫外比色法;苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性測定參考李合生[18]的生理生化試驗指導(dǎo)方法;多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性測定參考朱廣廉等[19]的植物生理學(xué)試驗方法;SOD活性測定采用氮藍四唑顯色法;APX活性、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)活性測定及此3種酶粗提液的制備,過氧化氫含量測定(H2O2),谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量測定均參考吳華[20]的方法;超氧陰離子自由基()產(chǎn)生速率測定采用李忠光等[21]的改進羥胺法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將原始數(shù)據(jù)錄入Microsoft Office Excel 2010,按公照式(2)計算各指標耐熱系數(shù)(熱害指數(shù)除外),運用SAS 9.4軟件對各品種各指標的耐熱系數(shù)及熱害指數(shù)進行ANOVA 方差分析、相關(guān)分析、回歸分析、主成分分析,利用公式(3)、(4)計算隸屬函數(shù)值(U),公式(5)計算權(quán)重(Wi),按照公式(6)計算綜合指標值D,并進行聚類分析,從而評價各品種的耐熱性。

隸屬函數(shù)與耐熱性呈正相關(guān)時,按照公式(3)計算;呈負相關(guān)時按照公式(4)計算:

式中,Xi:第i個綜合指標值;Xmin:第i個綜合指標的最小值;Xmax:第i個綜合指標的最大值。

式中,Pi:第i個綜合指標的貢獻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下不結(jié)球白菜各指標耐熱系數(shù)的方差分析及相關(guān)分析

由表3可知,不同品種的各指標耐熱系數(shù)均不同程度的偏離1,說明不同品種對于熱脅迫的響應(yīng)存在較大的差異。根據(jù)各性狀的平均值,37℃/27℃高溫處理5 d后,19個品種GSH、H2O2含量和O·-2產(chǎn)生速率的耐熱系數(shù)的平均值均小于1,說明高溫脅迫下這些指標都較正常生長的對照組有所降低,而APX、GR、SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性和MDA、AsA含量則較對照組高。

研究青梗不結(jié)球白菜品種的性狀多樣性發(fā)現(xiàn),13個性狀的平均變異系數(shù)為33.26%,其中APX活性變異系數(shù)最大,為65.558%,GR活性次之,PAL活性的變異系數(shù)最小,為13.214%。對各指標耐熱系數(shù)進行單因素ANOVA分析發(fā)現(xiàn),除產(chǎn)生速率在19種青梗不結(jié)球白菜之間存在顯著差異(P＜0.05),APX、GSH、GR、SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性,MDA、AsA、H2O2含量以及HII 均在不同品種之間存在極顯著差異(P＜0.01),說明不同的青梗不結(jié)球白菜品種在耐熱性上具有很好的遺傳多樣性,這13個指標都可以作為青梗不結(jié)球白菜耐熱性的鑒定指標。

表3 19種青梗不結(jié)球白菜耐熱系數(shù)及品種間變異分析Table3 Heat tolerance coefficient and variation among 19 varieties of green stalks non-heading Chinese cabbage

2.2 青梗不結(jié)球白菜各指標相關(guān)分析

對19種青梗不結(jié)球白菜的13個指標進行相關(guān)分析(表4),結(jié)果表明,各指標之間存在一定的正負相關(guān)關(guān)系。其中,APX活性耐熱系數(shù)與GR活性、生成速率的耐熱系數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.518、-0.502 ,H2O2含量與SOD活性耐熱系數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.498,均表現(xiàn)為顯著負相關(guān);PAL活性與GSH含量、HII與MDA含量的耐熱系數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.562、0.462,均為顯著正相關(guān),H2O2含量與O·-2產(chǎn)生速率的耐熱系數(shù)之間表現(xiàn)為極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.604。由此可知,青梗不結(jié)球白菜抵抗熱脅迫的反應(yīng)是一個綜合反應(yīng),單一指標不能準確解釋各品種間的耐熱能力,需要利用多元統(tǒng)計的方法評價不同品種的耐熱性。

表4 青梗不結(jié)球白菜13個指標耐熱系數(shù)的相關(guān)分析Table4 The correlation analysis of 13 indicators about heat-tolerance of non-heading Chinese cabbage

2.3 青梗不結(jié)球白菜各指標主成分分析

將各品種各指標數(shù)據(jù)進行主成分分析,對13個指標進行降維處理,根據(jù)特征值大于1的原則,得表5中5個主成分,對應(yīng)5個綜合指標,其對應(yīng)的貢獻率分別為22.6%、15.6%、14.7%、11.8%、9.7%,累計貢獻率為74.5%,解釋了全部74.5%的差異來源。各主成分中取絕對值大于0.35的特征向量為主要特征向量,因此決定綜合指標1的主要有MDA(0.399)、H2O2(-0.416)、(-0.378)、SOD(0.388)、POD(0.424),決定綜合指標2的主要有APX (- 0.513)、GR(0.412)、(0.357)、HII(0.377),決定綜合指標3的主要包括GSH (0.512)、AsA (- 0.424)、PAL(0.525),綜合指標4 主要由GR(-0.525)、CAT(0.510)決定,綜合指標5 主要由AsA(-0.474)、PPO(-0.491)、HII(0.350)決定。

表5 青梗不結(jié)球白菜指標主成分分析Table5 Principal component analysis of the index of non-heading Chinese Cabbage

2.4 青梗不結(jié)球白菜綜合指標隸屬函數(shù)分析

將原始數(shù)據(jù)標準化后與特征向量值計算5個綜合指標得分值(表6),綜合指標值越大耐熱性越強。根據(jù)各綜合指標主要特征向量指標的正負相關(guān)性選擇隸屬函數(shù)的計算公式,計算各品種的綜合指標隸屬函數(shù)值,并得到其平均值,計算綜合指標D值。耐熱性與D值呈正相關(guān)關(guān)系,根據(jù)D值大小,對各品種耐熱性進行排序,耐熱性前五的品種分別是青16、青20、青2、青18、青21,耐熱性弱的5個品種分別是青15、青8、青1、青5、青14)(表7)。

2.5 青梗不結(jié)球白菜耐熱回歸模型建立

將各品種所有指標耐熱系數(shù)及熱害指數(shù)(自變量)與D值(因變量)進行多元線性逐步回歸分析,所有變量顯著(P＜0.15)進入方程的有APX、MDA、AsA、POD、HII,共5個指標,最終獲得如下最優(yōu)方程:

D=0.752 75 - 0.021 90x1- 0.042 48x4- 0.034 08x5- 0.079 84x9- 0.225 61x13

其中,x1:APX;x4:MDA;x5:AsA;x9:POD;x13:HII。R2=0.908 3,信息量(Cp)= 2.182 6

通過回歸方程預(yù)測D值并檢驗其精度,精度范圍為77.5%～99.4%,其平均精度為93.2%,說明其預(yù)測精度高,可靠性強。

表6 青梗不結(jié)球白菜耐熱系數(shù)主成分得分值Table6 Principal component scores of heat-tolerant coefficient of non-heading Chinese Cabbage

2.6 青梗不結(jié)球白菜聚類分析

根據(jù)表7中D值可以判斷耐熱性較強的品種有青16、青20、青2,耐熱性弱的是青1、青8、青15。利用SAS 9.4軟件,采用離差平方和法,依據(jù)D值對19份青梗不結(jié)球白菜進行聚類分析(圖1),在R2=0.908時,將其聚為3類。第一類為青2、青18、青21、青17、青29、青20、青16,表現(xiàn)為強耐熱;第二類為青12、青24、青26、青30、青28、青19,表現(xiàn)為中耐熱;第三類為青1、青8、青15、青5、青14、青6,表現(xiàn)為熱敏感。

2.7 綜合評價

根據(jù)表3熱害指數(shù)分級標準將青梗不結(jié)球白菜進行分類:青5、青15為弱耐熱;青1、青8、青17、青19和青30 劃為弱至中;青2、青12、青14、青26,為中耐熱;青6、青24 劃為中至強;青18、青21、青28、青29劃為強耐熱;青16、青20 劃為強至極強。由圖1可知,青17與青19 屬于強耐熱類,與熱害指數(shù)分析結(jié)果有一定程度的差異,由此可見單憑熱害指數(shù)不能完全評價青梗不結(jié)球白菜的耐熱性,存在一定的單一性,借助多元統(tǒng)計分析可以從多角度綜合評價青梗不結(jié)球白菜的耐熱性。將聚類分析結(jié)果對進入回歸方程的指標進行歸類計算其耐熱系數(shù)平均值得表8,結(jié)果發(fā)現(xiàn)APX、MDA、HII、AsA、POD 隨耐熱性的增強其值越小。因此,在進行37℃/27℃熱脅迫5 d 處理時,可將APX、MDA、HII、AsA、POD 作為主要指標初步判別青梗不潔球白菜的耐熱性。

圖1 19種青梗不結(jié)球白菜D值聚類結(jié)果Fig.1 Clustering results of D value of 19 green stalked non-heading Chinese Cabbage

表7 青梗不結(jié)球白菜隸屬函數(shù)分析及綜合評價Table7 Membership function analysis and comprehensive evaluation of non-heading Chinese Cabbage

表8 各聚類的指標平均值Table8 Mean value of each cluster

3 討論

目前對植物耐熱性的研究已有很多報道。蔬菜植株受到高溫脅迫時,體內(nèi)會發(fā)生系列生理生化反應(yīng)來適應(yīng)高溫脅迫,從而降低熱害損傷,這是一個復(fù)雜的生理過程。近年來,多元統(tǒng)計分析方法被大量應(yīng)用在多指標綜合評價的研究中,如黃瓜耐鹽性[22]、萬壽菊屬耐熱與抗旱性[23]、甜瓜幼苗耐冷性[24]、苜蓿耐熱性[25]、荔枝耐貯藏性[26]以及叢枝菌根真菌(arbu scular mycorrhizal fungi,AM)對煤塌區(qū)土質(zhì)的影響[27]等,涉及了植物抗逆、果實品質(zhì)以及微生物等多方面。多元統(tǒng)計分析有利地提高了指標分析的準確性,其中主成分分析結(jié)合隸屬函數(shù)的分析方法被大量運用。

本試驗通過對19種來源不同的青梗不結(jié)球白菜施以37℃/27℃持續(xù)5 d的高溫脅迫,通過測定其抗氧化指標耐熱系數(shù)發(fā)現(xiàn),各品種除O·2-產(chǎn)生速率差異顯著,其他指標在品種之間均達極顯著差異;變異系數(shù)在13%～66%之間,變異度很大,說明不同的青梗不結(jié)球白菜品種在耐熱性上具有很好的遺傳多樣性,這13個指標都可以作為青梗不結(jié)球白菜耐熱性評價鑒定的指標。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),各品種GSH、H2O2含量和O·2-產(chǎn)生速率的耐熱系數(shù)均值小于1,說明處理5 d時,高溫脅迫處理的青梗不結(jié)球白菜總體含量低于正常生長的植株,這與前人研究[23,28-30]存在一定偏差,可能由于部分青梗不結(jié)球白菜耐熱性強,能快速應(yīng)對熱脅迫引起的活性氧增加,自身抗氧化酶活性大幅提高進而清除活性氧,并建立新的低水平活性氧平衡,使活性氧水平低于正常植株。

本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),各指標的耐熱系數(shù)之間存在一定的正負相關(guān)性,MDA含量的耐熱系數(shù)與HII呈顯著正相關(guān),也驗證了在熱害脅迫處理下,熱害現(xiàn)象越嚴重,細胞受損傷率越高,膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量越高,這與張娜[31]和付正來[32]的研究結(jié)果一致。H2O2與O·2-作為活性氧物質(zhì),熱害脅迫處理下其耐熱系數(shù)呈極顯著正相關(guān),APX活性與O·2-產(chǎn)生速率、SOD活性與H2O2含量的耐熱系數(shù)之間均呈顯著負相關(guān)。已知SOD與APX 均為活性氧清除相關(guān)的物質(zhì),其在抗逆性中起重要作用,一定程度上與耐熱性具有正相關(guān)[33-35],其本研究中也存在一定相關(guān)性但并未達顯著水平;本試驗中GR活性與APX活性的熱耐系數(shù)之間呈顯著負相關(guān),二者均能提高活性氧的清除能力,說明青梗不結(jié)球白菜受熱害脅迫5 d,二者活性沒有同時升高,APX活性在耐熱性強品種中較耐熱性弱品種低,與前人研究[35]存在差異,可能是熱脅迫時間不同或者APX 不是清除青梗不結(jié)球白菜活性氧的主要酶,具體原因還有待于進一步研究。

本研究聚類分析中,青2、青18、青21、青17、青29、青20和青16 表現(xiàn)為較強的耐熱性;青1、青8、青15、青5、青14、青6為熱敏感型,該結(jié)果與熱害指數(shù)結(jié)果不完全一致。由此可知,耐熱性是一個綜合性狀,采用熱害指數(shù)等單一指標不能準確評價青梗不結(jié)球白菜耐熱性,這與周亞峰等[24]和韓瑞宏等[25]對種子資源的非生物脅迫評價結(jié)論一致。植物耐熱機制復(fù)雜,不同品種之間存在性狀差異,單一指標評價不能消除品種間的性狀差異,會影響耐熱性評價的準確性。

4 結(jié)論

本研究最終獲得了耐熱性強的品種青16與青20,在聚類結(jié)果的綜合評價中APX、MDA、HII、AsA、POD與耐熱性成反比,也為后續(xù)篩選耐熱品種提供了直接鑒定指標。本研究獲得的耐熱性綜合評價模型D=0.752 75 - 0.021 90APX- 0.042 48MDA - 0.03408AsA- 0.079 84POD- 0.225 61HII,其預(yù)測值與實際測定值一致,因此該模型可用于青梗不結(jié)球白菜耐熱性綜合評價模型。本試驗篩選品種可為蔬菜種植戶夏秋季節(jié)渡淡種植提供選擇。本研究構(gòu)建了不結(jié)球白菜耐熱性與抗氧化指標的評估體系,并探究了抗氧化指標與耐熱性之間的關(guān)系,這對加快今后不結(jié)球白菜的抗熱育種具有重要意義。