孫全喜 徐洪明 李春娟 閆彩霞 趙小波王 娟 苑翠玲 單世華

(1山東省花生研究所,山東 青島 266100;2東阿縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站工作,山東 聊城 252200)

花生(Arachis hypogaeaL.)是重要的油料作物之一,其種子富含脂肪和蛋白質(zhì),是理想的“生物反應器”。自1993年獲得轉(zhuǎn)基因花生以來[1],陸續(xù)出現(xiàn)了以抗逆、品質(zhì)改良等為目標的轉(zhuǎn)基因花生的報道[2-6]。迄今為止,此類研究大都使用植物組成型表達啟動子(即目的外源基因在植物整株中表達),如煙草花葉病毒CamV35S 啟動子[7]。但在植物所有組織中持續(xù)高效表達目的基因會給植物生長發(fā)育帶來不利影響[8]。而組織特異啟動子作為一類專一性啟動子,能驅(qū)動外源基因在植物發(fā)育過程中某一特定時空表達[9]。它不僅能使目的基因的表達產(chǎn)物在一定空間積累,增加區(qū)域表達量,而且能避免植物營養(yǎng)的浪費[10-11]。種子特異啟動子可以驅(qū)動外源基因在種子中特異表達,這對花生種子遺傳改良具有重要的應用價值。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,陸續(xù)出現(xiàn)利用多基因聚合技術(shù),以高等植物種子作為“生物反應器”異源合成營養(yǎng)物質(zhì)的報道[12]。如,能生產(chǎn)維生素A的金色大米[13]、可產(chǎn)魚油的油菜籽[14]、能異源合成花青素的紫晶大米[15]以及紫胚玉米[16]等,這些“生物強化”農(nóng)作物的獲得均需要引進外源代謝途徑,而異源表達外源代謝途徑涉及的基因需借助啟動子的驅(qū)動。研究表明,多基因轉(zhuǎn)化過程中,若每個基因使用相同序列的啟動子,則存在大量重復序列,可能會造成轉(zhuǎn)基因沉默,每個基因表達盒選擇應使用不同序列的啟動子[17-18]。因此,若想借助花生種子作為“生物反應器”異源合成營養(yǎng)物質(zhì),獲得“生物強化”花生,需要克隆鑒定大量種子特異啟動子。然而,目前可以利用的花生種子特異啟動子較少,且均克隆自已知種子特異表達基因[10,19-20]。Paik-Ro 等[21]報道了花生PSC32基因(AF366560)在種子中表達,而在葉片、根和果針中不表達。因此,本試驗克隆了花生PSC32基因上游957 bp的啟動子片段,并借助轉(zhuǎn)基因擬南芥對其功能進行鑒定,以期為花生種子品質(zhì)改良或以花生種子作為“生物反應器”的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用試驗材料為花生(品種為花育33)和“Col0”生態(tài)型擬南芥,均由山東省花生研究所品種資源課題組保存。

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)、DNA 分子量標記、PCR mix 等購自北京全式金生物有限公司;高保真聚合酶Phusion、反轉(zhuǎn)錄酶、DNase 酶以及限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHI 購自加拿大Fermentas 公司;T4 DNA 連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司;用于GUS 組織化學底物X-Gluc 購自美國SIGMA 公司;質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;農(nóng)桿菌菌株GV3101和植物表達載體pBI121 由山東省花生研究所品種資源課題組保存。

1.2 PSC32基因內(nèi)源表達分析

設計PSC32基因特異引物PSC32-F和PSC32-R(表1),提取花育33 飽果成熟期根、莖、葉片、花、入土前的果針、成熟種子的果殼以及成熟種子的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用半定量RT-PCR方法檢測其在不同組織或器官中的表達情況,以花生Actin基因作為內(nèi)參基因[22]。PCR 反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,26個循環(huán);72℃后延伸10 min。

表1 本研究所用PCR 引物Table1 Sequence of PCR primers used in this study

1.3 順式作用元件分析

利用NewPLACE (https:/ /sogo.dna.affrc.go.jp/cgibin/sogo.cgi? lang=en&pj=640&action=page&page=newplace)在線分析序列中順式作用元件情況,如是否具有啟動子所具備的TATA 盒和CAAT 盒,以及種子或胚胎特異啟動子常有的RY REPEAT元件及其他的一些響應不同信號的保守序列。

1.4 AHSSP1 啟動子的克隆及其驅(qū)動GUS 報告基因表達載體的構(gòu)建

提取花育33 幼嫩葉片基因組,利用AHSSP1 特異引物AHSSP1-F和AHSSP1-R(表1)進行PCR 擴增。PCR 反應體系(50 μL):ddH2O 30.9 μL,5×HF buffer(含Mg2+)10 μL;dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL;AHSSP1-F和AHSSP1-R(5 μmol·L-1)各2 μL;DMSO 0.6 μL;Phusion 酶0.5 μL;基因組模板2 μL。擴增程序:98℃預變性30 s;98℃變性10 s,58℃退火10 s,72℃延伸50 s,28個循環(huán);72℃后延伸10 min。經(jīng)膠回收后,連接至克隆載體pEASY-Blunt Simple,經(jīng)桑尼生物科技有限公司測序正確后得到質(zhì)粒,并命名為pEASY-BAHSSP1。

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHI 將啟動子AHSSP1 片段在質(zhì)粒pEASY-B-AHSSP1 切下,在T4 連接酶的作用下,連接到經(jīng)相同酶切的植物表達載體pBI121 上,得到質(zhì)粒pBI121-AHSSP1。

1.5 農(nóng)桿菌介導的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定

利用熱激法將構(gòu)建好的質(zhì)粒pBI121-AHSSP1 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101,然后利用花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥[23]。收集農(nóng)桿菌侵染后的擬南芥T0種子,在無菌超凈工作臺上操作,用70%酒精處理1 min,2.6%次氯酸鈉處理10 min,再用無菌水沖洗4～5 次,分散置于含50 μg·mL-1卡那霉素的MS 培養(yǎng)基上。待T1卡那霉素抗性的擬南芥幼苗長出2 片子葉后,選取綠色健康的幼苗移栽到蛭石中[24],約2個月后收獲種子,用于后續(xù)試驗。

1.6 GUS 組織化學染色

預先配制GUS 染色液(含0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液、10 mmol·L-1EDTA、0.5 mmol·L-1鐵氰化鉀、0.5 mmol·L-1亞鐵氰化鉀、1 mmol·L-1X-Gluc和0.1%Triton X-100)[25]。先將試驗材料在90%丙酮中(冰浴)固定15～20 min,然后在染色液(不含X-Gluc)中漂洗3 次,再置于GUS 染色液(含X-Gluc)中,37℃恒溫放置12～16 h,最后用70%酒精脫色30 min,再用100%酒精脫色30 min[23],完成GUS 組織染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSC32基因在花生不同組織中的表達分析

經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn),PSC32基因編碼Conglutin蛋白,該蛋白是種子貯藏蛋白[26]。為進一步確定其組織表達特異性,利用半定量RT-PCR 檢測了該基因在花生根、莖、葉片、花、入土前果針、成熟種子的果殼和成熟種子中的內(nèi)源表達情況。由圖1可知,PSC32基因在花生成熟種子中有很強的表達信號,在根、莖、葉片、果針和果殼中均不表達,表明PSC32基因是一個種子特異表達基因,暗示其啟動子AHSSP1可能具有種子表達特異性。

圖1 PSC32基因在花生不同組織中的表達情況Fig.1 PSC32 gene expression profile in different tissues of peanut

2.2 AHSSP1 啟動子的克隆及順式作用元件分析

試驗設計了AHSSP1 啟動子多對特異引物,其中以AHSSP1-F1和AHSSP1-R1(表1)擴增得到一個大約1 000 bp的片段(圖2-A),經(jīng)膠回收后,連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple,獲得帶有目的啟動子片段的質(zhì)粒,命名為pEASY-B-AHSSP1。經(jīng)測序,得到其正確序列,選取其起始密碼子ATG 上游957 bp的片段進行順式作用元件分析,發(fā)現(xiàn)AHSSP1 序列含有重要的轉(zhuǎn)錄必備RNA 聚合酶結(jié)合位點TATA box、CAAT box,以及3個RY REPEAT元件,通常存在于種子貯藏蛋白啟動子中的2S SEED PROTBANAPA元件等(圖3、表2)。這進一步暗示AHSSP1可能是一個種子特異表達啟動子。此外,序列中還包含激素響應元件(如赤霉素、脫落酸和水楊酸等),以及響應光信號、低溫和高溫脅迫的元件。

2.3 AHSSP1 驅(qū)動GUS 報告基因表達載體的構(gòu)建

將pEASY-B-AHSSP1 用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHI 進行雙酶切,得到啟動子AHSSP1 片段,連接到同樣經(jīng)過HindⅢ和BamHI 酶切的植物表達載體pBI121中。此時,該載體中原來的煙草花葉病毒CaMV 35S 啟動子被AHSSP1 替代,得到目的表達載體pBI121-AHSSP1(圖2-B)。

圖2 啟動子AHSSP1的克隆及其表達載體構(gòu)建Fig.2 Cloning of promoter AHSSP1 and its expression vector construction for transformation

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及GUS 組織化學染色

將pBI121-AHSSP1 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101,利用花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥,收集農(nóng)桿菌侵染后的種子,在含50 μg·mL-1卡那霉素的MS 培養(yǎng)基上篩選,將綠色健康的抗性幼苗移栽到蛭石中。隨機選取了12株抗性苗進行PCR 檢測,發(fā)現(xiàn)均為轉(zhuǎn)基因陽性苗(圖4)。經(jīng)篩選得到T2轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體,分別對12個轉(zhuǎn)基因個體后代的不同組織進行GUS 化學染色。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟的種子(圖5-A)及萌發(fā)種子的子葉、下胚軸和胚根均能夠被染上藍色(圖5-C);長出真葉后,子葉和下胚軸仍能被染色,而根及真葉不能被染上藍色(圖5-E);成年期轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片也不能被染上藍色(圖5-G)。野生型擬南芥整個生長時期均不能被染上藍色(圖5-B、D、F)。上述結(jié)果表明,花生AHSSP1 啟動子可以驅(qū)動外源報告基因GUS在擬南芥種子種特異表達。

圖3 花生AHSSP1 啟動子序列和預測的順式作用元件Fig.3 AHSSP1 promoter sequence and predicted cis-acting elements

表2 AHSSP1 序列中存在的順式作用元件Table2 Putative cis-acting elements in AHSSP1 sequence

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR 檢測Fig.4 PCR detection of putative transgenic Arabidopsis

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS 組織化學染色Fig.5 Histochemical GUS assays of transgenic Arabidopsis

3 討論

花生種子富含油脂和蛋白質(zhì),是異源生產(chǎn)外源蛋白及次生代謝物的理想“生物反應器”。以花生種子中含量豐富的油酸和亞油酸為底物,在一系列延長酶和去飽和酶作用下,可異源生產(chǎn)超長鏈多不飽和脂肪酸花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA) (魚油的主要有效成分)[2]。種子特異啟動子可以驅(qū)動外源基因只在種子中表達,是實現(xiàn)這一目標的重要分子工具。然而,目前可供選擇使用的花生種子特異啟動子太少,本研究克隆了花生種子特異表達基因PSC32的啟動子,借助轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定了一個新的花生種子特異啟動子AHSSP1,豐富了花生種子特異啟動子資源。

文獻報道PSC32基因只在花生種子中表達[21],該基因編碼蛋白屬于種子貯藏蛋白藍豆蛋白(Conglutin)家族,此類蛋白在種子中表達量豐富[26]。本研究利用RT-PCR 分別對PSC32基因在花生栽培種花育33 各組織中的表達情況進行了檢測,發(fā)現(xiàn)該基因在花生種子中表達,而在花生根、莖、葉、花、果針、果殼中均不表達,進一步證實了PSC32基因是種子特異表達基因,暗示其啟動子是種子特異啟動子。為進一步驗證該結(jié)果,以PSC32基因起始密碼子ATG 上游約2 000 bp的序列為參考,設計了多對引物,但由于該序列AT含量豐富,只有AHSSP1-F1和AHSSP1-R1 引物擴增得到一個951 bp的片段。啟動子序列中順式作用元件的種類和數(shù)量決定著啟動子的表達方式[27]。分析PSC32 序列中存在的順式作用元件發(fā)現(xiàn),AHSSP1 序列中除具備啟動子所必需的TATA 盒、CAAT 盒等,還具有常存在于種子特異啟動子序列的RY REPEAT元件,2S SEED PROTBANAPA元件,胚乳蛋白表達相關的Skn-1元件,提高轉(zhuǎn)錄水平的5UTR Py-rich stretch元件,提供組織特異性-300 CORE元件等(圖3)。以上結(jié)果均說明AHSSP1 啟動子可能是個強表達種子特異啟動子。

目前,開展花生遺傳轉(zhuǎn)化的研究比較困難,而以擬南芥或煙草等作為模式植物,為花生啟動子的克隆鑒定提供了極大便利。本試驗借助轉(zhuǎn)基因擬南芥進行研究,發(fā)現(xiàn)PSC32 啟動子可驅(qū)動報告基因GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟種子,以及萌發(fā)種子的子葉、下胚軸和幼根中特異表達,證明AHSSP1 啟動子是一個種子特異啟動子,這與前人鑒定種子特異啟動子的方法一致[28-32]。

4 結(jié)論

本研究克隆并鑒定了一個新的花生種子特異表達啟動子AHSSP1,該啟動子可以驅(qū)動外源基因在種子中特異表達。本研究花生AHSSP1 啟動子的克隆鑒定為下一步以花生種子作為“生物反應器”,獲得“生物強化”花生提供了種子特異啟動子資源。