王 璐,馮 慧,馮成利
(陜西省動(dòng)物研究所,陜西 西安 710032)
野生動(dòng)物的非法獵殺、貿(mào)易等情況一直存在,而一些繳獲的非法貿(mào)易動(dòng)物因?yàn)橥庑卧獾狡茐?,無(wú)法從形態(tài)上進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,對(duì)于森林公安的執(zhí)法造成一定的影響。因此通過(guò)對(duì)動(dòng)物的皮毛、血液以及肌肉等進(jìn)行分子檢測(cè),得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果會(huì)對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)和打擊非法經(jīng)營(yíng)和走私野生動(dòng)物活動(dòng)有著重要的意義[1~3]。同理動(dòng)物肉制品因?yàn)閷儆谝环N半加工過(guò)的食品,存在著造假、以次充好的現(xiàn)象,常規(guī)的檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行有效的鑒定,而DNA水平的檢測(cè)將會(huì)很好地解決這一難題。
細(xì)胞色素B(Cyto chrome b, Cytb)基因位于線粒體環(huán)狀DNA中,是編碼線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素b氧化酶的基因的一個(gè)亞基,由線粒體DNA H鏈所編碼。它的起源非常古老,在幾乎所有的真核生物和許多原核生物中都有發(fā)現(xiàn),它不但在屬間、種間存在多樣性,而且在品種間、品種內(nèi)個(gè)體間都存在多樣性,因此Cytb基因是研究種間進(jìn)化關(guān)系的最佳基因之一[4~5]。通過(guò)對(duì)物種Cytb基因的檢測(cè)對(duì)比,可以準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行鑒別分類(lèi)。
研究的實(shí)例樣品分別來(lái)自?xún)煞矫?,一方面是陜西省森林公安送檢的非法貿(mào)易動(dòng)物肌肉樣品,另一方面是從附近的串串店取材的肉質(zhì)食品。
1.2.1 總基因組DNA的提取以及PCR擴(kuò)增 用Promega試劑盒提取樣品DNA,提取出來(lái)后取5 μL,用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè),其余-20℃保存。
PCR擴(kuò)增的目的片段為線粒體DNA細(xì)胞色素B基因部分片斷序列,大小約460bp,引物選取線粒體DNACytb通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。
表1 樣品信息
(S0609-1189F)Cytb-F 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'
(S0609-1189R)Cytb-R 5'-CTCACCTGATATTTGTCCTCA-3
'PCR反應(yīng)在PTC-200 PCR儀(BIO-RAD)中進(jìn)行,擴(kuò)增條件如表2。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè),-20℃保存。
1.2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將得到的PCR產(chǎn)物按照96孔純化板純化操作后,進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)體系為:2 uL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H2O),2 uL純化后的產(chǎn)物,1 uL引物(5 mmol·L-1)。測(cè)試反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán)條件95℃ 15s,(95℃ 15s 50℃ 5s 60℃ 90s)x35循環(huán),終止反應(yīng)。
將樣品測(cè)出來(lái)的Cytb基因序列與基因庫(kù)里的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比,得到的進(jìn)化樹(shù)關(guān)系圖分別如圖1、圖2、圖3。
可以看出樣品J1、J2都是與野豬的遺傳的距離最為接近,J3與羊的遺傳的距離最為接近。再進(jìn)行一對(duì)一的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)測(cè)出來(lái)Cytb基因序列匹配率都在99%以上,因此可以判定森林公安送檢的J1、J2是野豬,J3就是普通的山羊。
表2 PCR反應(yīng)體系及條件
提取的肉質(zhì)食品樣品都是已知的,因此將四個(gè)樣品分別羊、牛、豬和雞的標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如表3。經(jīng)過(guò)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)R1、R2、R3的檢測(cè)結(jié)果表明沒(méi)有問(wèn)題,但是R4檢測(cè)出來(lái)并不是雞肉,而是牛肉。
表3 肉質(zhì)食品樣品Cytb基因序列對(duì)比
運(yùn)用細(xì)胞色素B基因檢測(cè)方法對(duì)動(dòng)物肉制食品的的真假鑒定相對(duì)簡(jiǎn)單,一是動(dòng)物肉制食品都是比較常見(jiàn)的物種,檢測(cè)范圍比較小;另外一個(gè)方面我們只需將要檢測(cè)肉制食品樣品與標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列進(jìn)行一對(duì)一的比對(duì),序列匹配就說(shuō)明是真的,反之證明是假的。而非法貿(mào)易野生動(dòng)物的Cytb基因序列鑒定則要建立在有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列庫(kù)基礎(chǔ)上,將未知?jiǎng)游飿悠穾脒M(jìn)行比對(duì),從而得出正確的結(jié)果。相對(duì)于普通的形態(tài)學(xué)鑒定,分子鑒定手段在物種鑒定方面更為準(zhǔn)確,而且隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,包含細(xì)胞色素B基因檢測(cè)方法在內(nèi)的DNA鑒定方法也在不斷進(jìn)步,我們堅(jiān)信在未來(lái)DNA分子技術(shù)將會(huì)在物種鑒定方面發(fā)展的更為迅捷、有效,為打擊野生動(dòng)物非法貿(mào)易以及食品安全提供有力的技術(shù)支撐。