王 璐,馮 慧,馮成利

(陜西省動(dòng)物研究所,陜西 西安 710032)

野生動(dòng)物的非法獵殺、貿(mào)易等情況一直存在，而一些繳獲的非法貿(mào)易動(dòng)物因?yàn)橥庑卧獾狡茐?，無法從形態(tài)上進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，對(duì)于森林公安的執(zhí)法造成一定的影響。因此通過對(duì)動(dòng)物的皮毛、血液以及肌肉等進(jìn)行分子檢測，得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果會(huì)對(duì)野生動(dòng)物保護(hù)和打擊非法經(jīng)營和走私野生動(dòng)物活動(dòng)有著重要的意義[1～3]。同理動(dòng)物肉制品因?yàn)閷儆谝环N半加工過的食品，存在著造假、以次充好的現(xiàn)象，常規(guī)的檢測無法進(jìn)行有效的鑒定，而DNA水平的檢測將會(huì)很好地解決這一難題。

細(xì)胞色素B(Cyto chrome b, Cytb)基因位于線粒體環(huán)狀DNA中，是編碼線粒體內(nèi)膜上細(xì)胞色素b氧化酶的基因的一個(gè)亞基，由線粒體DNA H鏈所編碼。它的起源非常古老，在幾乎所有的真核生物和許多原核生物中都有發(fā)現(xiàn)，它不但在屬間、種間存在多樣性，而且在品種間、品種內(nèi)個(gè)體間都存在多樣性，因此Cytb基因是研究種間進(jìn)化關(guān)系的最佳基因之一[4～5]。通過對(duì)物種Cytb基因的檢測對(duì)比，可以準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行鑒別分類。

1 材料和方法

1.1 材料

研究的實(shí)例樣品分別來自兩方面，一方面是陜西省森林公安送檢的非法貿(mào)易動(dòng)物肌肉樣品，另一方面是從附近的串串店取材的肉質(zhì)食品。

1.2 方法

1.2.1 總基因組DNA的提取以及PCR擴(kuò)增 用Promega試劑盒提取樣品DNA，提取出來后取5 μL，用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，其余-20℃保存。

PCR擴(kuò)增的目的片段為線粒體DNA細(xì)胞色素B基因部分片斷序列，大小約460bp，引物選取線粒體DNACytb通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 樣品信息

(S0609-1189F)Cytb-F 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'

(S0609-1189R)Cytb-R 5'-CTCACCTGATATTTGTCCTCA-3

'PCR反應(yīng)在PTC-200 PCR儀(BIO-RAD)中進(jìn)行，擴(kuò)增條件如表2。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，-20℃保存。

1.2.2 PCR產(chǎn)物測序 將得到的PCR產(chǎn)物按照96孔純化板純化操作后，進(jìn)行測序。測序反應(yīng)體系為：2 uL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H2O)，2 uL純化后的產(chǎn)物，1 uL引物(5 mmol·L-1)。測試反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán)條件95℃ 15s，(95℃ 15s 50℃ 5s 60℃ 90s)x35循環(huán)，終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 森林公安送檢樣品

將樣品測出來的Cytb基因序列與基因庫里的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比，得到的進(jìn)化樹關(guān)系圖分別如圖1、圖2、圖3。

可以看出樣品J1、J2都是與野豬的遺傳的距離最為接近，J3與羊的遺傳的距離最為接近。再進(jìn)行一對(duì)一的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測出來Cytb基因序列匹配率都在99%以上，因此可以判定森林公安送檢的J1、J2是野豬，J3就是普通的山羊。

表2 PCR反應(yīng)體系及條件

2.2 串串店所提取肉制食品樣品

提取的肉質(zhì)食品樣品都是已知的，因此將四個(gè)樣品分別羊、牛、豬和雞的標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表3。經(jīng)過檢測我們發(fā)現(xiàn)R1、R2、R3的檢測結(jié)果表明沒有問題，但是R4檢測出來并不是雞肉，而是牛肉。

表3 肉質(zhì)食品樣品Cytb基因序列對(duì)比

3 分析討論

運(yùn)用細(xì)胞色素B基因檢測方法對(duì)動(dòng)物肉制食品的的真假鑒定相對(duì)簡單，一是動(dòng)物肉制食品都是比較常見的物種，檢測范圍比較??；另外一個(gè)方面我們只需將要檢測肉制食品樣品與標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列進(jìn)行一對(duì)一的比對(duì)，序列匹配就說明是真的，反之證明是假的。而非法貿(mào)易野生動(dòng)物的Cytb基因序列鑒定則要建立在有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Cytb基因序列庫基礎(chǔ)上，將未知?jiǎng)游飿悠穾脒M(jìn)行比對(duì)，從而得出正確的結(jié)果。相對(duì)于普通的形態(tài)學(xué)鑒定，分子鑒定手段在物種鑒定方面更為準(zhǔn)確，而且隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，包含細(xì)胞色素B基因檢測方法在內(nèi)的DNA鑒定方法也在不斷進(jìn)步，我們堅(jiān)信在未來DNA分子技術(shù)將會(huì)在物種鑒定方面發(fā)展的更為迅捷、有效，為打擊野生動(dòng)物非法貿(mào)易以及食品安全提供有力的技術(shù)支撐。