吳 寬, 米偉麗, 吳云鋒

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

植物病毒病是僅次于真菌病害的第二大類植物病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失。目前我國已報道的植物病毒種類約1 100種，每年造成的危害達到600億元，由于防治困難, 嚴(yán)重影響著農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，素有“植物癌癥”之稱。因此，開發(fā)新型的微生物源抗植物病毒活性藥劑具有重要的意義。

實驗室前期從秦嶺山分離獲得雜色云芝菌(Trametes versicolor)，命名為秦嶺菌株YZ5，通過單因素與正交實驗設(shè)計獲得了雜色云芝糖肽液態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配方的優(yōu)化組成，進一步發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物云芝糖肽(PSP)具有抗煙草花葉病毒(TMV)功能[1]。然而，研究發(fā)現(xiàn)雜色云芝菌菌絲體內(nèi)和體外都能夠產(chǎn)生多糖，雜色云芝菌菌絲體發(fā)酵液中提取的胞外多糖是一種不含肽的葡聚糖[2]，從菌絲體中提取的胞內(nèi)多糖是含蛋白質(zhì)的糖肽，具有抗病毒活性[3～4]。需要探索秦嶺菌株YZ5胞內(nèi)多糖的發(fā)酵條件，目前尚未研究報道。

為提高雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵多糖產(chǎn)量，在單因素基礎(chǔ)上，實驗通過響應(yīng)面法(RSM)以最經(jīng)濟的方式，較少的實驗次數(shù)和較短的時間對發(fā)酵條件繼續(xù)優(yōu)化研究[5～6]，為實現(xiàn)云芝糖肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 雜色云芝菌(Trametes versicolor)由農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室從秦嶺山林地采集，鑒定與保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)

液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蔗糖10 g，酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，K2HPO42 g，KH2PO41.5 g，MgSO41.5 g，蒸餾水1 L，自然pH。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵條件 雜色云芝菌菌絲接種于PDA平面，28℃避光培養(yǎng)7 d。搖瓶裝液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接種量10%，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)7 d。

1.2.2 響應(yīng)面分析實驗 根據(jù)發(fā)酵條件單因素實驗結(jié)果，選擇發(fā)酵液的初始pH、轉(zhuǎn)速和溫度為自變量，生物量和胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，選擇各單因素最優(yōu)值作為Box-Behnken試驗的中心點，根據(jù)Box-Behnken實驗原理，利用Design-Expert 10.0 軟件設(shè)計三因素三水平，共17個試驗點的中心組合試驗，實驗設(shè)計如表1。

表1 Box-Behnken試驗因素和水平

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗

雜色云芝菌菌絲接種于液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，搖瓶裝液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接種量10%，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)果表明生物量為9.4 g·L-1，胞外多糖為1.45 g·L-1。

2.2 響應(yīng)面分析實驗

表2 發(fā)酵條件的Box-Behnken試驗

通過響應(yīng)面法實驗，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)初始pH5、接種量8%和溫度28℃培育7 d時，生物量和胞外多糖產(chǎn)量最低，分別為生物量5.21 g·L-1和胞外多糖1.2 g·L-1。當(dāng)初始pH6、接種量10%和溫度28℃培育7d時，生物量和胞外多糖均產(chǎn)量最高，分別為生物量10.54 g·L-1和胞外多糖2.11 g·L-1。

利用Design-Expert 10.0軟件將實驗結(jié)果二次回歸擬合，進行結(jié)果分析。得到生物量回歸方程如下：生物量=10.9+0.2×A+0.73×B+0.063×C-0.077×AB+0.023×AC+0.52×BC-2.64×A2-1.86×B2-2.19×C2

表3 生物量回歸方程方差分析

注：**極顯著；**顯著。

由上述所得到的結(jié)果，使用軟件(Design-Expert 10.0)進行響應(yīng)面分析，獲得了相應(yīng)的立體圖1。圖中的各個響應(yīng)面表示兩者的相互作用?？梢钥闯?，發(fā)酵條件中的初始pH、接種量和溫度與云芝發(fā)酵產(chǎn)生的生物量存在顯著的相關(guān)性，其中接種量和初始pH對云芝液態(tài)發(fā)酵得到的生物量的影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著接種量和初始pH的提高，云芝發(fā)酵所得生物量也會明顯增加。等高線圖顯示圓形則說明交互作用不顯著，顯示為橢圓形則說明交互作用顯著，所以，由圖可知初始酸堿度和溫度交互作用不顯著，接種量和初始酸堿度以及接種量和溫度交互作用顯著。

表4 胞外多糖回歸方程方差分析

注：***極顯著；*顯著

結(jié)果表明(圖2)初始pH、接種量和溫度與胞外多糖產(chǎn)量存在顯著相關(guān)性，其中接種量和初始pH對胞外多糖產(chǎn)量影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著接種量和初始pH的提高，生物量增加。由等高線圖看出，初始pH和溫度、接種量和溫度的等高線圖接近圓形，交互作用是不顯著的，而接種量和初始pH的等高線圖接近橢圓形，交互作用顯著。

2.3 最佳發(fā)酵條件的驗證

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計結(jié)果，利用Design-Expert 10.0軟件對模型進行預(yù)測得到：當(dāng)初始pH為6.51157、接種量為10.5342%、溫度為27.129時，生物量為10.967g·L-1,胞外多糖產(chǎn)量為2.034 g·L-1。為了驗證實驗結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進行了驗證性實驗，實驗得生物量10.82 g·L-1，胞外多糖1.98 g·L-1，結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化雜色云芝菌液體發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件：初始pH6.5、裝液量 100 mL·250 mL-1、接種量10%、溫度27℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)7d。優(yōu)化后雜色云芝菌液體發(fā)酵的胞外多糖為1.98 g·L-1，較優(yōu)化前胞外多糖提升2.33倍。

4 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)雜色云芝菌胞內(nèi)糖肽對煙草花葉病毒TMV有顯著的抑制作用，希望開發(fā)一種新的抗病毒劑。因此，需要開展PSP發(fā)酵條件的優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)。

試驗采用的菌株是經(jīng)過實驗室前期鑒定，篩選獲得的優(yōu)良菌株，在此基礎(chǔ)上采用單因素篩選、正交設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基進行深入優(yōu)化，以期得到更高的產(chǎn)量和質(zhì)量。試驗對雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵條件進行響應(yīng)面法優(yōu)化，獲得PSP高合成發(fā)酵條件，為雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生多糖的工業(yè)化提供重要參考。