吳 寬, 米偉麗, 吳云鋒

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

植物病毒病是僅次于真菌病害的第二大類植物病害，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失。目前我國已報(bào)道的植物病毒種類約1 100種，每年造成的危害達(dá)到600億元，由于防治困難, 嚴(yán)重影響著農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，素有“植物癌癥”之稱。因此，開發(fā)新型的微生物源抗植物病毒活性藥劑具有重要的意義。

實(shí)驗(yàn)室前期從秦嶺山分離獲得雜色云芝菌(Trametes versicolor)，命名為秦嶺菌株YZ5，通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了雜色云芝糖肽液態(tài)發(fā)酵基質(zhì)配方的優(yōu)化組成，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物云芝糖肽(PSP)具有抗煙草花葉病毒(TMV)功能[1]。然而，研究發(fā)現(xiàn)雜色云芝菌菌絲體內(nèi)和體外都能夠產(chǎn)生多糖，雜色云芝菌菌絲體發(fā)酵液中提取的胞外多糖是一種不含肽的葡聚糖[2]，從菌絲體中提取的胞內(nèi)多糖是含蛋白質(zhì)的糖肽，具有抗病毒活性[3～4]。需要探索秦嶺菌株YZ5胞內(nèi)多糖的發(fā)酵條件，目前尚未研究報(bào)道。

為提高雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵多糖產(chǎn)量，在單因素基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法(RSM)以最經(jīng)濟(jì)的方式，較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較短的時間對發(fā)酵條件繼續(xù)優(yōu)化研究[5～6]，為實(shí)現(xiàn)云芝糖肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 雜色云芝菌(Trametes versicolor)由農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從秦嶺山林地采集，鑒定與保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)

液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蔗糖10 g，酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，K2HPO42 g，KH2PO41.5 g，MgSO41.5 g，蒸餾水1 L，自然pH。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵條件 雜色云芝菌菌絲接種于PDA平面，28℃避光培養(yǎng)7 d。搖瓶裝液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接種量10%，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)7 d。

1.2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 根據(jù)發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵液的初始pH、轉(zhuǎn)速和溫度為自變量，生物量和胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，選擇各單因素最優(yōu)值作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理，利用Design-Expert 10.0 軟件設(shè)計(jì)三因素三水平，共17個試驗(yàn)點(diǎn)的中心組合試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

雜色云芝菌菌絲接種于液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，搖瓶裝液量100 mL·250 mL-1三角瓶，初始pH6、接種量10%，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)7 d。發(fā)酵結(jié)果表明生物量為9.4 g·L-1，胞外多糖為1.45 g·L-1。

2.2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

表2 發(fā)酵條件的Box-Behnken試驗(yàn)

通過響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)初始pH5、接種量8%和溫度28℃培育7 d時，生物量和胞外多糖產(chǎn)量最低，分別為生物量5.21 g·L-1和胞外多糖1.2 g·L-1。當(dāng)初始pH6、接種量10%和溫度28℃培育7d時，生物量和胞外多糖均產(chǎn)量最高，分別為生物量10.54 g·L-1和胞外多糖2.11 g·L-1。

利用Design-Expert 10.0軟件將實(shí)驗(yàn)結(jié)果二次回歸擬合，進(jìn)行結(jié)果分析。得到生物量回歸方程如下：生物量=10.9+0.2×A+0.73×B+0.063×C-0.077×AB+0.023×AC+0.52×BC-2.64×A2-1.86×B2-2.19×C2

表3 生物量回歸方程方差分析

注：**極顯著；**顯著。

由上述所得到的結(jié)果，使用軟件(Design-Expert 10.0)進(jìn)行響應(yīng)面分析，獲得了相應(yīng)的立體圖1。圖中的各個響應(yīng)面表示兩者的相互作用。可以看出，發(fā)酵條件中的初始pH、接種量和溫度與云芝發(fā)酵產(chǎn)生的生物量存在顯著的相關(guān)性，其中接種量和初始pH對云芝液態(tài)發(fā)酵得到的生物量的影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著接種量和初始pH的提高，云芝發(fā)酵所得生物量也會明顯增加。等高線圖顯示圓形則說明交互作用不顯著，顯示為橢圓形則說明交互作用顯著，所以，由圖可知初始酸堿度和溫度交互作用不顯著，接種量和初始酸堿度以及接種量和溫度交互作用顯著。

表4 胞外多糖回歸方程方差分析

注：***極顯著；*顯著

結(jié)果表明(圖2)初始pH、接種量和溫度與胞外多糖產(chǎn)量存在顯著相關(guān)性，其中接種量和初始pH對胞外多糖產(chǎn)量影響較為顯著。在一定范圍內(nèi)，隨著接種量和初始pH的提高，生物量增加。由等高線圖看出，初始pH和溫度、接種量和溫度的等高線圖接近圓形，交互作用是不顯著的，而接種量和初始pH的等高線圖接近橢圓形，交互作用顯著。

2.3 最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果，利用Design-Expert 10.0軟件對模型進(jìn)行預(yù)測得到：當(dāng)初始pH為6.51157、接種量為10.5342%、溫度為27.129時，生物量為10.967g·L-1,胞外多糖產(chǎn)量為2.034 g·L-1。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化條件進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得生物量10.82 g·L-1，胞外多糖1.98 g·L-1，結(jié)果與模型預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化雜色云芝菌液體發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件：初始pH6.5、裝液量 100 mL·250 mL-1、接種量10%、溫度27℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1培養(yǎng)7d。優(yōu)化后雜色云芝菌液體發(fā)酵的胞外多糖為1.98 g·L-1，較優(yōu)化前胞外多糖提升2.33倍。

4 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)雜色云芝菌胞內(nèi)糖肽對煙草花葉病毒TMV有顯著的抑制作用，希望開發(fā)一種新的抗病毒劑。因此，需要開展PSP發(fā)酵條件的優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)。

試驗(yàn)采用的菌株是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室前期鑒定，篩選獲得的優(yōu)良菌株，在此基礎(chǔ)上采用單因素篩選、正交設(shè)計(jì)對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行深入優(yōu)化，以期得到更高的產(chǎn)量和質(zhì)量。試驗(yàn)對雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，獲得PSP高合成發(fā)酵條件，為雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生多糖的工業(yè)化提供重要參考。