王軍利，千小綿，吳紫安，羊 波，李 偉，王 新

(1.咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 西咸新區(qū) 712046；2.陜西省農(nóng)業(yè)宣傳信息中心，陜西 西安 710003；3.紫陽(yáng)縣蒿坪鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，陜西 紫陽(yáng) 725300；4.漢中市漢臺(tái)區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，陜西 漢中 723000；5.安康市漢濱區(qū)石梯鎮(zhèn)農(nóng)綜站，陜西 安康 725000)

薔薇科草莓屬的植物在全世界約有50種，其中全球廣為栽培的草莓，是由八倍體鳳梨草莓(Fragariaananassa)培育而成的栽培種，其他倍性的草莓則多呈野生或半野生狀態(tài)分布于全球各地[1～2]。常見的野生草莓約有20種，中國(guó)自然分布約11種，秦巴山地為中國(guó)野生草莓的主要集生地之一，大約有7種，分別是二倍體(2x)的森林草莓(F.vescaL.)、黃毛草莓(F.nilgrrensisSchlecht.)、五葉草莓(F.pentaphyllaLonzink.)和纖細(xì)草莓(F.mubicolaLindl.)，以及四倍體(4x)的東方草莓(F.orientalisLozinsk.)、傘房草莓(F.corymbosaLozinsk.)和西南草莓(F.moupinensis(Franch)Card.)[2～6]。為了開發(fā)、利用野生草莓資源，我國(guó)各地大量的科研人員進(jìn)行很多努力，對(duì)我國(guó)野生草莓資源的分布進(jìn)行調(diào)查和鑒定[1～5]、對(duì)野生草莓進(jìn)行引種馴化[6]、利用野生資源進(jìn)行常規(guī)育種[7～8]、用組織培養(yǎng)的方法對(duì)部分野生草莓進(jìn)行培養(yǎng)與快繁[9、10]等，但對(duì)于秦巴山地野生草莓資源的組培研究，所見資料甚少。為了開發(fā)利用秦巴山地的野生草莓資源，筆者在前人工作的基礎(chǔ)上，研究了秦巴山地野生五葉草莓的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，為五葉草莓的離體再生提供了實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為其離體染色體加倍提供了前期的實(shí)驗(yàn)材料，也為秦巴山地其他野生草莓的組培快繁提供了參考路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的五葉草莓源自陜西省秦巴山區(qū)。項(xiàng)目組將其采挖回來后，栽培在咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院儀祉農(nóng)林學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地的專門苗圃。野生五葉草莓植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，匍匐莖和葉柄被直立絨毛，花序梗和小花梗亦密被直立絨毛，小葉5，極稀3，葉片質(zhì)地較厚，正面無(wú)毛，背面被疏絨毛，宿萼反折，果實(shí)白色，圓形或橢圓形，種子多枚，陷于果面下。根據(jù)這些特征，項(xiàng)目組運(yùn)用《中國(guó)植物志》[11]《秦嶺植物志》[12]《中國(guó)果樹分類學(xué)》[13]及其他相關(guān)檢索、鑒定資料(雷家軍，2004)[14]，對(duì)其進(jìn)行了鑒定。

1.2 方法

1.2.1 五葉草莓無(wú)菌苗的獲得 在秦巴山地草莓屬野生植物資源苗圃地，選無(wú)病蟲害的五葉草莓健壯苗，用剪刀剪取2 cm左右的匍匐莖頂端，放置在大燒杯中，置于水龍頭下流水沖洗4～6 h，再在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌鑷子將其夾出，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒35 s，然后再用2%的NaClO消毒10～15 min，用無(wú)菌水沖洗4～6次，再用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分，在墊有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中用滅菌后放涼的解剖刀切取長(zhǎng)約0.5～1.0 cm的莖尖(帶有一個(gè)葉原基)作為外植體，接種在Ph=5.8～6.0的MS+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂粉的固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種3個(gè)外植體。接種后，將培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，期間注意觀察污染情況，及時(shí)將未被污染的外植體轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：光照時(shí)長(zhǎng)為15 h/d，光強(qiáng)為1 500～2 000 Lux，溫度為25(±2)℃。消毒過程中，由于五葉草莓通體被有絨毛，為使消毒徹底，每一步都不斷振搖或攪拌。

1.2.2 不同濃度的6-BA對(duì)五葉草莓離體增殖的影響 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂粉7 g·L-1，pH5.8～6.0，NAA濃度為0.1 mg·L-1。6-BA設(shè)置4個(gè)濃度處理：0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.6 mg·L-1。選取生長(zhǎng)均勻，高度3～5 cm，具有4片葉子的五葉草莓無(wú)根試管苗接種到該培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)瓶接種4個(gè)無(wú)根試管苗，每個(gè)處理接種15瓶。接種30 d后，統(tǒng)計(jì)外植體增殖倍數(shù)。

1.2.3 基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素種類對(duì)五葉草莓生根的影響 基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素的選擇設(shè)4種配比方式：MS+0.2 mg·L-1IBA、MS+0.2 mg·L-1NAA、1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA以及1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。無(wú)根草莓試管苗的選?。哼x取在MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)健壯的無(wú)根草莓苗，高度5 cm左右，具有5片葉子。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3株無(wú)根試管苗。接種30 d后，觀察根系生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)生根數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五葉草莓無(wú)菌苗的獲得

五葉草莓無(wú)菌苗的獲得過程中，接種3 d后開始褐化，褐化比率近乎90%，最終褐化致死率達(dá)67.1%。褐化程度不嚴(yán)重、未致死的消毒莖尖，在接種21 d時(shí)，不經(jīng)愈傷組織階段開始萌發(fā)新芽，并最終形成叢生芽，獲得五葉草莓無(wú)菌苗。

2.2 不同濃度的6-BA對(duì)五葉草莓離體增殖的影響

將由莖尖培養(yǎng)后選取的相同規(guī)格的五葉草莓無(wú)菌苗，接種在6-BA不同濃度處理的5種增殖培養(yǎng)基上，30 d后觀察增殖苗生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)增殖數(shù)量，計(jì)算出增殖倍數(shù)。結(jié)果見表1。

由表1可見，當(dāng)6-BA的濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，五葉草莓長(zhǎng)勢(shì)健壯，但增殖倍數(shù)較低；當(dāng)6-BA的濃度增加到0.3 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)增加，增殖苗生長(zhǎng)健壯，葉色濃綠；當(dāng)6-BA的濃度增加到0.4 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)繼續(xù)增加，外殖體增殖苗長(zhǎng)勢(shì)良好。但當(dāng)6-BA濃度增加到0.5 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)越過峰值開始下降，且增殖苗長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，偶有黃化現(xiàn)象；而6-BA濃度增加到0.6mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)下降幅度很大，大多未見增殖，苗低矮、畸形，黃化程度比較嚴(yán)重。由此可見，當(dāng)基本培養(yǎng)基為MS，NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，五葉草莓離體增殖的最佳6-BA添加濃度為0.4 mg·L-1。

2.3 基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素種類對(duì)五葉草莓生根的影響

選取生長(zhǎng)健壯的同規(guī)格的五葉草莓無(wú)根試管苗接種在4種不同的生根培養(yǎng)基上，30 d后，觀察其誘導(dǎo)生根情況，結(jié)果見表2。

表1 不同濃度6-BA對(duì)五葉草莓無(wú)菌苗增殖的影響

表2 基本培養(yǎng)基及生長(zhǎng)素對(duì)五葉草莓生根的影響

在實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行時(shí)可以觀察到，無(wú)論哪種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，1/2 MS培養(yǎng)基上的無(wú)根試管苗生根都早于MS培養(yǎng)基。由表2可見：當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物為IBA時(shí)，無(wú)論1/2 MS培養(yǎng)基還是MS培養(yǎng)基，接種30 d后，五葉草莓的無(wú)根試管苗的生根率都達(dá)到100%，高于NAA的誘導(dǎo)率，但NAA為添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，誘導(dǎo)生成的根普遍粗壯，長(zhǎng)度也普遍大于以IBA為誘導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。株平均誘導(dǎo)根數(shù)以1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA培養(yǎng)基為最大，每株達(dá)6.9根，且長(zhǎng)度超過1.0 cm的根在總根數(shù)中占比超過41.1%。雖然IBA作為生根調(diào)節(jié)劑的生根率更高，但NAA作為添加的生根調(diào)節(jié)劑時(shí)，誘導(dǎo)的根更粗壯、更長(zhǎng)、單株生根數(shù)更多，植株在練苗后更容易成活而長(zhǎng)成健壯幼苗；另外，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，超過37 d時(shí)，NAA為調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)生根率也達(dá)到100%。故此，誘導(dǎo)五葉草莓無(wú)根試管苗生根的合適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。

3 討論與結(jié)論

秦巴山區(qū)有豐富的野生草莓資源。較之于栽培草莓，野生草莓在抗病蟲害、抗逆性、可溶性有機(jī)物含量、果實(shí)顏色豐富度以及果實(shí)香味物質(zhì)種類等方面，有較大的優(yōu)勢(shì)[1～6]。為了利用這些自然資源，有必要對(duì)其進(jìn)行搜集、整理、研究。野生五葉草莓長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，生命力旺盛，葉片厚，濃綠，果實(shí)顏色為栽培草莓中少見的白色，果肉細(xì)膩綿軟，香味濃郁，是優(yōu)質(zhì)的雜交育種資源，也是通過倍性增加、細(xì)胞融合甚至轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行育種的優(yōu)質(zhì)基因源[1～6、14]，對(duì)其進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，建立莖尖培養(yǎng)組培快繁技術(shù)，為其離體再生、染色體加倍及細(xì)胞融合等工作奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于其野生資源的開發(fā)、利用，具有重要意義。

在外殖體的獲得時(shí)，發(fā)現(xiàn)剝?nèi)〉那o尖越小，褐化死亡率越高；越大，越有利于外植體成活，這與王會(huì)[10]對(duì)紅石美草莓及王燕[9]對(duì)黃毛草莓的研究結(jié)論一致，可見在草莓組織培養(yǎng)外殖體的切取過程中，組織越幼嫩、切口相對(duì)越大，外植體越容易褐化。在6-BA對(duì)五葉草莓離體增殖的研究中，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度在培養(yǎng)基中含量的增加，草莓離體增殖倍數(shù)增大，但超過一定的峰值后，反而下降，這與王燕[9]對(duì)黃毛草莓的研究結(jié)論一致。在基本培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素對(duì)五葉草莓生根的影響實(shí)驗(yàn)中，IBA作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物時(shí)，30 d試管苗生根率達(dá)100%，無(wú)論哪種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，1/2 MS培養(yǎng)基上的無(wú)根試管苗生根都早于MS培養(yǎng)基，這些都和王燕[9]對(duì)黃毛草莓的研究結(jié)論一致，但在NAA作為調(diào)節(jié)物生成的根粗壯、結(jié)實(shí)，這與王燕[9]對(duì)黃毛草莓的研究結(jié)論不一致。可見，同為草莓屬植物，在實(shí)驗(yàn)條件基本一致時(shí)，不同的種，實(shí)驗(yàn)結(jié)論會(huì)有不同。所以不同植物材料進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，具體植物的合適培養(yǎng)基和添加劑，要通過實(shí)驗(yàn)取得。

實(shí)驗(yàn)中得到以下結(jié)論：利用野生五葉草莓匍匐莖莖尖在MS+0.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)基上獲得無(wú)菌苗，適合五葉草莓快繁的培養(yǎng)基為MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，增值倍數(shù)為8.150；適合其誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA，單株誘導(dǎo)根數(shù)最大，誘導(dǎo)根粗，長(zhǎng)度長(zhǎng)，有利于形成壯苗。