聶永莉， 湯世敏， 彭 芳， 許 濤， 毛永榮

(1. 國藥漢江醫(yī)院腫瘤科， 湖北 丹江口 442700； 2. 長(zhǎng)江大學(xué)機(jī)能學(xué)部， 湖北 荊州 434023； 3. 十堰市人民醫(yī)院腫瘤科， 湖北 十堰 442000； 4. 湖北省腫瘤醫(yī)院病理科， 湖北 武漢 430079)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，也是男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。其通常是一種遲發(fā)性疾病，63%的確診男性年齡在65歲及以上，且發(fā)病率逐年上升[1-2]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA-191的異常表達(dá)具有致癌性[3-5]。研究報(bào)道[6-7]，miRNA-191可調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲和分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。miRNA-191在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)患者中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)OCI-LY10細(xì)胞增殖侵襲。然而目前miRNA-191對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力影響的研究鮮見報(bào)道。

磷脂酶C δ1(PLCD1)編碼一種參與能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的酶，定位于第3號(hào)染色體短臂22.3區(qū)，在多個(gè)癌癥中經(jīng)常低表達(dá)[8]。研究表明，結(jié)直腸癌中PLCD1的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且PLCD1可抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)G1 / S期細(xì)胞周期停滯[9]。本研究通過檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系中miRNA-191的表達(dá)，建立miRNA-191表達(dá)抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞，探討miRNA-191靶向PLCD1對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響及其相關(guān)機(jī)制，為前列腺癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人正常前列腺細(xì)胞RWPE-2和人前列癌細(xì)胞系(PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1，美國ATCC公司)；胎牛血清(美國 Gibco 公司)；miRNA-191抑制劑和陰性對(duì)照(廣州市銳博生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol Reagent、miRNA-191和U6引物(美國Invitrogen公司)；RT-qPCR引物(上海生工公司)；SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)；兔抗PLCD1單克隆抗體(Abcam公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Santa Cruze公司)；雙熒光素酶基因報(bào)告檢測(cè)試劑盒(Promega)；結(jié)晶紫溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1人前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；將RWPE-2人正常前列腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各細(xì)胞系，采用實(shí)時(shí)定量PCR法(RT-qPCR法)檢測(cè)各細(xì)胞系中miRNA-191表達(dá)水平，選擇PC-3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-3細(xì)胞接種于24孔板(2×105cells/well)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，分別將5 nmol/L miRNA-191抑制劑和5 nmol/L miRNA-191 Inhibitor NC溶于無血清培養(yǎng)基中；將1 μl Lipofectamine 2000溶于無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min。將miRNA-191抑制劑或miRNA-191 Inhibitor NC與Lipofectamine 2000混合后室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染期間將24孔板培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，每孔400 μl，轉(zhuǎn)染6 h后更換含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR法(RT-qPCR法)檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-191和PLCD1 mRNA表達(dá)水平

Trizol法提取轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA-191和PLCD1基因的表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下：miRNA-191正向5'-ACACTCCAGCTGGGCAACCGAATCCCAAAAGC-3'，反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PLCD1正向5'-TGTCGCTACTCAAGTGAGTC-3'；反向5'-AGTCCTCCTGAACTTGTAG-3'；β-actin正向5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。mRNA表達(dá)水平按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

1.5 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞PLCD1的蛋白表達(dá)

分別收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，振蕩離心后提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，經(jīng)過SDS-PAGE分離膠后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入PLCD1一抗(1∶1 000稀釋)，4℃冰箱孵育過夜。加入二抗(1∶3 000稀釋)，室溫雜交1 h，ECL化學(xué)發(fā)光，于暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組細(xì)胞中PLCD1蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.6 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平

將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞按每孔5×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔培養(yǎng)液總量為100 μl。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔450 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的遷移能力

將各組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，用高壓滅菌的200 μl槍頭在孔內(nèi)輕輕劃1-3道痕，用PBS清洗并去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照，計(jì)算相對(duì)劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞侵襲法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的侵襲能力

取200 μl細(xì)胞(5×105cells/ml)加入上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基700 μl，于37℃培養(yǎng)24 h。將膜下面的細(xì)胞與1%多聚甲醛混合，0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min。顯微鏡計(jì)數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

采用生物信息學(xué)軟件TargetScan選擇PLCD1基因，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。分別構(gòu)建野生型PLCD1-Wt和突變型PLCD1-Mut重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒與miRNA-191 Inhibitor或miRNA-191 NC共轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miRNA-191在不同前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

本研究通過RT-qPCR法檢測(cè)PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1 4種人前列癌細(xì)胞系及RWPE-2細(xì)胞中miRNA-191的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與RWPE-2細(xì)胞相比，人前列癌細(xì)胞中miNRA-191的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且PC-3細(xì)胞中miNRA-191的表達(dá)水平較其他3種細(xì)胞系顯著上調(diào)(P<0.05，表1)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇PC-3細(xì)胞系用于后續(xù)研究。

Tab. 1 Expressions of miRNA-191 in different prostate cancer cell n=3)

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較

與空白對(duì)照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of PC-3 cell proliferation ability, migration and invasion in Different Groups n=3)

2.3 miRNA-191對(duì)PC-3細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

與空白對(duì)照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度增加，細(xì)胞侵襲水平顯著降低(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度和細(xì)胞侵襲水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞相對(duì)劃痕寬度增加，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05，表2，圖1)。

Fig. 1 Effects of miRNA-191 on migration and invasion of PC-3 cells

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-191與PLCD1的靶向關(guān)系

miRNA-191與PLCD1基因3’UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-191和PLCD1能夠靶向結(jié)合，見圖2。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型PLCD1基因表達(dá)載體WT-3’UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor細(xì)胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染miRNA-191 NC組顯著升高(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型PLCD1基因表達(dá)載體Mutant-3’UTR后，再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor的PC-3細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

Fig. 2 miRNA-191 targeted combination with PLCD1 3'UTR

Tab. 3 Effect of microRNA191 on migration and invasion of PC-3 cells

2.5 各組PLCD1蛋白及mRNA表達(dá)水平

與空白對(duì)照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞中PLCD1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細(xì)胞中PLCD1蛋白及mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細(xì)胞中PLCD1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高(P< 0.05，表4，圖3。)

Tab. 4 Expression levels of PLCD1 protein and mRNA in each group

Fig. 3 Expression level of PLCD1 protein in each group

3 討論

前列腺癌是泌尿外科最具挑戰(zhàn)性的惡性腫瘤之一，隨著血清前列腺特異性抗原(PSA)篩查的普及，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但其具體病因尚不明確。因此，了解參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，深入探討前列腺癌的相關(guān)分子機(jī)制[10-11]，對(duì)前列腺癌的防治具有重要意義。miRNA-191在多種癌癥中呈高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡，并啟動(dòng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12-15]。磷脂酶C(PLC)在激素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、生長(zhǎng)因子信號(hào)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)等胞內(nèi)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。PLCD1基因編碼的酶能夠調(diào)節(jié)能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)及胞內(nèi)信號(hào)通路，其在許多腫瘤中被確定為抑癌基因，包括食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌及乳腺癌等[16-17]。

本研究通過RT-PCR法檢測(cè)PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1 4種人前列癌細(xì)胞系及RWPE-2細(xì)胞中miRNA-191的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與RWPE-2細(xì)胞相比，人前列癌細(xì)胞中miNRA-191的表達(dá)水平顯著升高，且PC-3細(xì)胞中miNRA-191的表達(dá)水平較其他3種細(xì)胞系顯著上調(diào)。因此，本研究選擇PC-3細(xì)胞系作為研究對(duì)象用于后續(xù)研究。在轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制劑后，PC-3細(xì)胞PLCD1表達(dá)水平較空白對(duì)照組和miRNA-191 NC group組顯著升高。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)驗(yàn)證miRNA-191與PLCD1的靶向關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型PLCD1基因表達(dá)載體WT-3’UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor細(xì)胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染miRNA-191 NC group組顯著升高；而轉(zhuǎn)染突變性PLCD1基因表達(dá)載體Mutant-3’UTR后，再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor的PC-3細(xì)胞熒光素酶活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，PLCD1基因是miRNA-191的靶基因。

miRNAs是一類可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子，通過靶向作用mRNA的3’UTR，降解靶mRNA或者抑制其翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物功能，其作為人類癌癥的診斷生物標(biāo)志物發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[18]。有研究報(bào)道，miRNA-191在人乳腺癌細(xì)胞中特別是ER(+)乳腺癌中高表達(dá)，轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制體后，MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲能力明顯受到抑制[19]；另有研究發(fā)現(xiàn)，PLCD1作為重要的增殖抑制基因，可阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)程進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)入PLCD1可促進(jìn)CAPAN-1和BXPC-3胰腺癌細(xì)胞的凋亡并使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，同時(shí)抑制其增殖、侵襲和遷移[20]。Mu等[21]研究發(fā)現(xiàn)PLCD1可通過誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯和凋亡，在體外對(duì)人乳腺癌細(xì)胞具有顯著的抗增殖作用。本研究在轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制劑后，PC-3細(xì)胞增殖能力受到抑制，相對(duì)劃痕寬度增加、細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)減少；提示miRNA-191可促進(jìn)PC-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，PLCD1基因是miRNA-191的下游靶基因，其表達(dá)被miRNA-191抑制。miRNA-191在前列腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，可通過靶向調(diào)控PLCD1對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲具有一定的促進(jìn)作用。因此，miRNA-191作為潛在前列腺癌miRNA治療的候選基因提供了重要的依據(jù)。