金 艷， 劉文明

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院急診內(nèi)科， 2. 重癥監(jiān)護(hù)室， 江蘇 常州 213000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，可引起肺臟及肺外臟器功能受損及代謝紊亂，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一[1]。雖然COPD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)參與多種肺部疾病的發(fā)病機(jī)制，包括發(fā)育障礙、纖維化、組織重塑及肺癌[2]。多配體蛋白多糖-1(syndecan-1)是一種細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖，作為細(xì)胞外基質(zhì)受體參與細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)粘附[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，syndecan-1在COPD患者血清中呈下降趨勢(shì)，且與小氣道阻塞參數(shù)呈正相關(guān)，與C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)[4]。由此推測(cè)，syndecan-1在COPD模型大鼠肺組織中表達(dá)降低，而過表達(dá)syndecan-1后可改善肺組織損傷。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染攜帶大鼠syndecan-1基因的重組腺病毒載體，上調(diào)Syndecan-1基因的表達(dá)，探討過表達(dá)syndecan-1在COPD大鼠肺EMT中的作用及機(jī)制研究，為臨床治療COPD提供新的靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，8～12周，體重200～240 g，購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK(滇)K2016-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑 DAB顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；vimentin、E-cadherin、TGF-β1、Smad2/3、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)；TGF-β1單克隆抗體、Smad2/3單克隆抗體、p-Smad2/3多克隆抗體、山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；iBright FL1500智能成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與模型制備

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、COPD大鼠模型組和COPD+syndecan-1過表達(dá)組，每組10只。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，采用煙熏聯(lián)合氣管注射脂多糖建立COPD大鼠模型，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠于造模第1、14日予腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，將大鼠仰臥位固定于鼠板上，暴露氣管，注射脂多糖200 μg/200 μl(1 mg/ml)后縫合皮膚，切口消毒，待大鼠清醒后放回原鼠盒中飼養(yǎng)。假手術(shù)組暴露氣管后注射等量的生理鹽水。

COPD組于術(shù)后第2～13、15～28日，每天上、下午置于煙熏箱內(nèi)被動(dòng)吸煙處理，每次0.5 h，共30 d，2次煙熏間隔時(shí)間大于或等于5 h，間隔期記錄大鼠攝食、排便、活動(dòng)等狀態(tài)數(shù)據(jù)。假手術(shù)組繼續(xù)正常飼養(yǎng)30 d。模型建立完成后轉(zhuǎn)染100 μl攜帶大鼠syndecan-1基因的重組腺病毒載體Ad-CMV-GFP-SDC1，為syndecan-1過表達(dá)組，COPD組轉(zhuǎn)染100 μl空載病毒，假手術(shù)組不作處理。

1.3 標(biāo)本采集

連續(xù)處理2周后將各組大鼠麻醉，暴露器官進(jìn)行肺功能檢測(cè)；檢測(cè)結(jié)束后取肺組織，將右肺下葉用10%中性甲醛固定，并進(jìn)行石蠟包埋，用于HE病理學(xué)檢測(cè)和免疫組化檢測(cè)；取右肺中葉用0.9%冷生理鹽水，充分研磨制成10%肺組織勻漿，3 000 r/min，4℃離心10 min，取上清，用于qRT-PCR檢測(cè)；剩余肺組織保存至-80℃冰箱，用于Western blot檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠肺功能檢測(cè) 處理結(jié)束24 h后，各組大鼠分別麻醉后將Y型插管插入氣管，Y型另兩端分別與流速傳感器、壓力傳感器連接，流速傳感器與小動(dòng)物呼吸器連接。分別檢測(cè)每分鐘呼氣量(VE)、最大呼氣流量(PEF)和0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)。

1.4.2 大鼠氣道肺組織病理學(xué)的HE檢測(cè) 麻醉取右肺下葉標(biāo)本，用10%中性甲醛固定24 h，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、蘇木精染色、切片。于光鏡下觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.4.3 大鼠肺組織syndecan-1、vimentin、E-cadherin表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 將石蠟包埋好的組織行4 μm連續(xù)切片，60℃烤箱中烘烤3～4 h；二甲苯溶液脫蠟3次，每次15 min，梯度乙醇逐步水化，每次3 min；PBS清洗后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)10 min，清洗；3%過氧化氫甲醇溶液封閉10 min，清洗；加山羊血清后靜置15 min后滴加一抗，4℃孵育過夜；37℃下復(fù)溫30 min，清洗；滴加二抗孵育15 min，清洗滴加二氨基聯(lián)苯胺后觀察染色情況；蘇木素染色，中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察syndecan-1、vimentin、E-cadherin蛋白陽性表達(dá)情況。

1.4.4 大鼠肺組織TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè) 取肺臟組織加入預(yù)冷的RIPA裂解液，冰浴放置30 min，提取總蛋白并進(jìn)行定量。進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別一抗(1∶2 000稀釋)的脫脂牛奶中4℃過夜。洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，洗膜，取適量ECL試劑顯影5 min，采用iBright FL1500智能成像系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.4.5 大鼠肺組織vimentin、E-cadherin、TGF-β1和Smad2/3 mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測(cè) 取肺組織勻漿加入1 ml Trizol提取肺組織總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肺組織vimentin、E-cadherin、TGF-β1和Smad2/3 mRNA表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下：vimentin上游5'-CTCTCAAAGATGCCCAGGAG-3'，下游5'-GCACGATCCAACTCTTCCTC-3'；E-cadherin上游5'-TGGACAGGGAGGATTTTGAG-3'，下游5'-ACCTGAGGCTTTGGATTCCT-3’；TGF-β1上游5'-CGGAGTTGTGCGGCAGTGGTTGA-3'；下游5'-GCGCCCGGGGTTATGCTGGTTGTA-3'；Smad2/3上游5'-TCCACCAGGCTGTAATCTCAAGA-3'；下游5'-GACATGCTTGAGCAACTGACT-3'；GAPDH上游5'-CTACCCACGGCAAGTTCAAT-3'，下游5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。每組重復(fù)3次。各基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能比較

與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠VE、PEF、FEV0.3均顯著降低(P<0.05)；與COPD組相比，syndecan-1過表達(dá)組大鼠VE、PEF、FEV0.3均顯著升高(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Results of pulmonary function test in each

2.2 各組大鼠氣道肺組織病理學(xué)檢查

光鏡下觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠氣道壁完整，氣道腔無狹窄，肺組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無肺氣腫形成；COPD組大鼠氣道黏膜脫落，管腔狹窄，氣道壁較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺氣腫嚴(yán)重；syndecan-1過表達(dá)組大鼠氣道黏膜脫落及氣道壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)減少，管腔狹窄、肺氣腫情況均有所改善(圖1)。

Fig. 1 Histopathological findings of airway and lung in each group (HE staining ×100)

2.3 各組大鼠肺組織中syndecan-1的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，syndecan-1的表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染為淡黃及棕黃色為陽性表達(dá)。與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織syndecan-1陽性表達(dá)減少而syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織syndecan-1陽性表達(dá)增加(圖2)。

Fig. 2 Expression level of syndecan-1 in lung tissue of rats in each group (Immunohistochemistry SP method ×200)

2.4 各組大鼠肺組織中vimentin、E-cadherin的表達(dá)水平

免疫組化結(jié)果顯示，vimentin陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin陽性主要定位于細(xì)胞膜。與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織vimentin mRNA表達(dá)水平升高而E-cadherin mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與COPD組相比，syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織vimentin mRNA表達(dá)水平降低而E-cadherin mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05，圖3，圖4，表2)。

Fig. 3 Expression level of vimentin in lung tissue of rats in each group (SP immunohistochemical method ×200)

Fig. 4 Expression level of E-cadherin in lung tissue of rats in each group (Immunohistochemistry SP method ×200)

Tab. 2 Expressions of vimentin and E-cadher mRNA in lung tissue of rats in each n=10)

2.5 各組大鼠肺組織中TGF-β1和Smad2/3的表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2/3 mRNA表達(dá)水平，TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與COPD組相比，syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2/3 mRNA表達(dá)水平，TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05，表3，表4，圖5)。

Tab. 3 Expressions of TGF - β1 and Smad2/3 mRNA in lung tissue of rats in each n=10)

Tab. 4 Expressions of TGF - β1 and Smad2/3 protein in lung tissue of rats in each n=3)

Fig. 5 Expressions of TGF-β1 and Smad2/3 protein in lung tissue of rats in each group

3 討論

COPD已成為全球常見疾病，其發(fā)病率一直在上升，吸煙是COPD發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素[6]。本研究通過煙熏聯(lián)合氣管注射脂多糖建立COPD大鼠模型，通過肺組織病理學(xué)變化及肺功能變化判斷COPD模型是否建立成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠氣道壁完整，氣道腔無狹窄，肺組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無肺氣腫形成；COPD組大鼠氣道黏膜脫落，管腔狹窄，氣道壁較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺氣腫嚴(yán)重；與假手術(shù)組相比，COPD組VE、PEF、FEV0.3均顯著降低。上述結(jié)果均提示本研究COPD大鼠模型建立成功。

EMT被認(rèn)為是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子[7]。目前已有研究表明，COPD患者的支氣管上皮細(xì)胞波形蛋白的表達(dá)增加，上皮鈣粘蛋白的表達(dá)減少，表明EMT參與了COPD的發(fā)生發(fā)展[8]。上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)屬于鈣依賴性跨膜粘附蛋白家族成員，在調(diào)節(jié)器官、組織形態(tài)發(fā)育和維持組織結(jié)構(gòu)完整性方面具有重要作用，起到預(yù)防和減少腫瘤細(xì)胞粘附的作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)展過程中E-cadherin表達(dá)降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間粘附力下降，促進(jìn)EMT的發(fā)生[10]。波形蛋白(vimentin)是一種細(xì)胞骨架蛋白，也是一種重要的間質(zhì)標(biāo)志物，是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵因子[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，vimentin在多種上皮性腫瘤中也有異常表達(dá)，與癌細(xì)胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，vimentin陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織vimentin mRNA表達(dá)水平顯著升高；E-cadherin陽性主要定位于細(xì)胞膜，與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平顯著降低；上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示COPD模型大鼠肺臟發(fā)生EMT。

有研究表明，EMT形成與多種信號(hào)通路有關(guān)，主要包括TGF-β/Smad及WNT/β-catein信號(hào)通路[13]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一種分泌到腫瘤微環(huán)境中的多功能細(xì)胞因子，可依賴Smads信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生，導(dǎo)致纖維化[14]?？讜晕涞热薣15]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β信號(hào)通路可下調(diào)vimentin蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平，減輕EMT誘導(dǎo)膀胱癌轉(zhuǎn)移。代煒等人[16]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可通過轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(MTA1)下調(diào)E-cadherin表達(dá)并促進(jìn)舌癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2/3 mRNA水平較假手術(shù)組均顯著升高，且肺組織中TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示COPD模型大鼠TGF-β/Smad信號(hào)通路激活，促進(jìn)vimentin的表達(dá)，抑制E-cadherin的表達(dá)，參與EMT的發(fā)生。

Syndecan-1是維持正常上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性的重要因素之一，參與細(xì)胞粘附、上皮形態(tài)發(fā)生和血管生成[17]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞表面syndecan-1表達(dá)減少和缺少可導(dǎo)致細(xì)胞的粘附能力下降，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤的浸潤(rùn)、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，syndecan-1的表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜染為淡黃及棕黃色為陽性表達(dá)。與假手術(shù)組相比，COPD組大鼠肺組織syndecan-1陽性表達(dá)顯著減少；syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織syndecan-1陽性表達(dá)顯著增加。HE染色結(jié)果顯示，syndecan-1過表達(dá)組大鼠氣道黏膜脫落及氣道壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)減少，管腔狹窄、肺氣腫情況均有所改善；與COPD組相比，syndecan-1過表達(dá)組VE、PEF、FEV0.3均顯著升高，提示過表達(dá)syndecan-1可保護(hù)COPD大鼠的肺臟損傷。與COPD組相比，syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織vimentin mRNA表達(dá)水平降低而E-cadherin mRNA表達(dá)水平升高；此外，syndecan-1過表達(dá)組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2/3 mRNA顯著降低、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示過表達(dá)syndecan-1可抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，減輕EMT，改善COPD大鼠肺組織損傷。

綜上所述，COPD大鼠體內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)通路活化且存在肺EMT；過表達(dá)syndecan-1可抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，減輕EMT，改善COPD大鼠肺組織損傷，為治療COPD提供新思路。