蘇海容， 程文姚， 袁秋虹， 歐陽菁， 鄧偉民,3△

(1. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)科， 2. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院軍隊(duì)傷病員管理科， 廣東 廣州 510010； 3. 前海人壽廣州總醫(yī)院康復(fù)科， 廣東 廣州 511300； 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)2017級在讀博士研究生， 廣東 廣州 510405)

生長激素(growth hormone,GH)對人的影響重大，主要表現(xiàn)為青年時(shí)期骨長度的生長和成年后骨量的維持。而胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)作為GH刺激肝臟產(chǎn)生的激素對骨代謝同等重要。GH和IGF-1分別與成骨細(xì)胞上的GH受體(growth hormone receptor,GHR)和IGF-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)結(jié)合可刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，從而增加骨密度(bone mineral density,BMD)。在垂體發(fā)育過程中，雌激素(estrogen,E2)可引起GH細(xì)胞的增殖與分化，在成年時(shí)，可維持垂體GH細(xì)胞的數(shù)量[1]。有研究發(fā)現(xiàn)激素替代治療(estrogen replacement theropy,ERT)可提高卵巢切除骨質(zhì)疏松大鼠股骨BMD和血清GH、IGF-1水平[2,3]，E2直接與下丘腦雌激素受體(estrogen receptors, ER)結(jié)合，一方面可能通過生長激素釋放激素的增加間接使GH分泌增加，另一方面可能直接作用于垂體前葉的生長激素細(xì)胞從而增加GH的分泌[4]。但長期E2治療可能增加冠心病和乳腺癌發(fā)生率以及腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，由于長期激素替代治療治療弊大于利，激素替代治療不再推薦用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,PMO)預(yù)防和治療的一線藥物。因此，尋找一種E2作用類似但副作用小的治療藥物具有重要意義。補(bǔ)腎壯骨顆粒治療PMO療效肯定，副作用小，團(tuán)隊(duì)前期對其作了大量相關(guān)研究[5,6-8]，但其具體作用機(jī)理仍須進(jìn)一步探討。本研究通過去卵巢建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，運(yùn)用補(bǔ)腎壯骨顆粒干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠，同時(shí)選用治療PMO療效確切的西藥戊酸雌二醇作為陽性對照組，對比觀察補(bǔ)腎壯骨顆粒促進(jìn)骨形成的效果，推測補(bǔ)腎壯骨顆粒促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨形成的作用可能是通過調(diào)控血清GH和IGF-1濃度及其骨組織中受體的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的，為臨床應(yīng)用治療提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

6月齡SPF級SD未育雌性大鼠48只，體重273±21.3 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，大鼠隨機(jī)分為12只假手術(shù)組(SHAM)和36只手術(shù)組(OVX)，建立去卵巢骨質(zhì)疏松模型后，手術(shù)組隨機(jī)分為模型組(OVX組)，戊酸雌二醇(E2組)，補(bǔ)腎壯骨顆粒組(BSZG組)，每組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎壯骨顆粒由龜板膠、鹿角膠、水蛭、生地、淫羊藿、山藥、骨碎補(bǔ)等中藥組成(10 g/袋,南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，批號15K04001)。戊酸雌二醇(E2)(補(bǔ)佳樂，1 mg/片，德國先靈公司生產(chǎn)，廣州先靈藥業(yè)有限公司分裝，國藥準(zhǔn)字J20030089)，由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器

試劑：GH一抗抗體(abcam公司生產(chǎn))，GH二抗為山羊抗兔鼠通用二抗(上?；蚩萍脊旧a(chǎn))，TRIzol Reagent(天根生產(chǎn))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI生產(chǎn))，熒光定量PCR檢測試劑盒(Genecopies生產(chǎn))，大鼠生長激素(GH)ELISA試劑盒(酶免生產(chǎn))，大鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISA試劑盒(酶免生產(chǎn))。儀器：臺式高速離心機(jī)(SCIlogex公司生產(chǎn))，純水儀(重慶艾科浦生產(chǎn))，熒光定量PCR儀(ABI生產(chǎn))，微量核酸定量儀(Merinton生產(chǎn))，基因擴(kuò)增儀(珠海黑馬生產(chǎn))，多功能酶標(biāo)儀(南京東華電子公司)，光密度及陽性細(xì)胞分析軟件采用Image J，美國GE雙能X線骨密度儀(型號：Prodigy由通用電氣(中國)有限公司生產(chǎn))。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模 術(shù)前禁食6 h，無菌條件下，按3 ml/kg水合氯醛(濃度為10%)進(jìn)行腹腔注射，俯位固定，于腰椎兩側(cè)旁約1 cm處縱行切開皮膚，皮下及肌肉組織分離后，手術(shù)組找到雙側(cè)卵巢，子宮角處結(jié)扎后摘除，SHAM組大鼠僅切除卵巢周圍與卵巢組織大小相當(dāng)?shù)闹窘M織。術(shù)后大腿肌肉注射40 KU/(kg·d)青霉素，連續(xù)用藥3 d，以防術(shù)后感染。

1.4.2 給藥方法 術(shù)后2周，各組大鼠均存活。各組大鼠每日定時(shí)灌胃給藥1次，BSZG組給予補(bǔ)腎壯骨顆粒最佳治療劑量為2.5 g/(kg·d)[5]，給藥濃度為0.25 g/ml。按照人與動物體表面積比值折算得等效給藥劑量，E2組給藥量為0.071 mg/(kg·d)，給藥濃度為7.1 μg/ml，SHAM組及OVX組灌服等量生理鹽水10 ml/kg。每周稱量體重1次，根據(jù)體重調(diào)整受試藥物劑量。連續(xù)給藥3個(gè)月后，每組隨機(jī)選取半數(shù)大鼠取材，剩下繼續(xù)前干預(yù)至6個(gè)月末取材。

1.4.3 取材 最后一次灌胃后2 h，每組隨機(jī)選取半數(shù)大鼠麻醉，活體測定其脊柱及股骨頸BMD，酒精浸泡下半身消毒，隨后腹主動脈取血，靜置2h，即時(shí)分離血清，3 000 r/min離心5 min后，吸取血清置-80℃冰箱保存。取完血標(biāo)本后迅速處死，取出垂體，用濾紙吸干，再用4%多聚甲醛固定，垂體放入該固定液后固定4 h( 4℃)，梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm。迅速取其左側(cè)脛骨，剔凈其上軟組織后，0.9%生理鹽水洗凈后用無菌紗布包裹放于-20℃保存。

1.4.4 指標(biāo)檢測 骨密度儀檢測，重點(diǎn)檢測部位為脊柱和股骨。ELISA法檢測血清GH及IGF-1濃度，qPCR法檢測左側(cè)脛骨組織GHR、IGF-1R的表達(dá)水平(GHR引物序列為：GAATGTCCGAGACAGCAGATAC,IGF-1R引物序列為CAATATC A CAGACCCGGAAGAG)。電子顯微鏡和JVCCCD攝像頭攝像采集腦垂體免疫組化片,顯微放大倍數(shù)40×，垂體GH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的檢測系統(tǒng)通過每張切片隨機(jī)選10個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。最后采用Image J軟件分析光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠脊柱及股骨BMD的影響

股骨BMD比較：(1)兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組較OVX組高(P<0.05),與SHAM組比較不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，BSZG組及E2組與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(2)干預(yù)3個(gè)月后，E2組與OVX組、BSZG組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，6個(gè)月后，E2組較OVX組高(P<0.05)，與BSZG組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。

脊柱BMD比較：(1)兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組和E2組均較OVX組上升(P<0.05)，但兩藥物干預(yù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(2)干預(yù)3個(gè)月后，兩藥物干預(yù)組與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)；干預(yù)6個(gè)月后E2組低于SHAM組(P< 0.05，表1)。

Tab. 1 Femoral and vertebral BMD of rats in each group(g/cm2， n=6)

2.2 補(bǔ)腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠血清GH/IGF-1水平的影響

大鼠血清IGF-1水平比較：(1)兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：OVX組低于SHAM組(P<0.05)；BSZG組高于OVX組高(P<0.05)，與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(2)干預(yù)3個(gè)月后，E2組與OVX組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，低于SHAM及BSZG組(P<0.05)；6個(gè)月后，E2組較SHAM、OVX及BSZG組低(P<0.05，表2)。

血清GH水平比較：(1)兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG和E2組均較OVX組上升(P<0.05)，兩藥物干預(yù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(2)干預(yù)3個(gè)月后，E2組較SHAM組低(P<0.05)，BSZG組與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；干預(yù)6個(gè)月后，兩藥物干預(yù)組與SHAM比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of serum IGF-1and GH expressionlevels in each group(ng/ml, n=6)

2.3 補(bǔ)腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠脛骨GHR及IGF-1R表達(dá)水平的影響

IGF-1R相對表達(dá)水平比較：兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：(1)OVX組較SHAM組下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均OVX組上升(P均<0.05)，兩藥物干預(yù)組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，兩藥物干預(yù)組與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表3)。

GHR相對表達(dá)水平比較：(1)兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為:OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組和E2均較OVX組高(P均<0.05)。(2)干預(yù)3個(gè)月后，E2組較SHAM組和BSZG組低(P均< 0.05)；但干預(yù)6個(gè)月后，E2組與SHAM組及BSZG組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of the relative expression levels of left tibial GHR and IGF-1R in rats in each group(ng/ml, n=6)

2.4 補(bǔ)腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠垂體光密度及陽性細(xì)胞數(shù)的影響

光密度值比較：兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：(1)與SHAM組相比，OVX組有所下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均較OVX組升高(P均<0.05)，兩藥物干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表4，圖1)。

GH陽性細(xì)胞數(shù)比較：兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：(1)OVX組較SHAM組下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均較OVX組上升(均P<0.05)；兩藥物干預(yù)組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，與SHAM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表4，圖1)。

Tab. 4 Comparison of optical density and GH cell count of pituitary immunostaining in each n=6)

Fig. 1 The pituitary gland (10×), The GH cells were observed by pituitary gland immunohistochemistry (20×)

2.5 骨密度與有關(guān)變量之間的相關(guān)性分析

血清GH和IGF-1濃度、骨組織GHR和IGF-1表達(dá)水平與股骨BMD呈正相關(guān)(分別為r=0.725，P<0.01；r=0.469，P<0.01；r=0.660，P<0.01；r= 0.648，P<0.01)；血清GH和IGF-1濃度、骨組織GHR和IGF-1表達(dá)水平與脊柱BMD呈正相關(guān)(分別為r=0.707，P<0.01；r=0.429，P<0.01；r= 0.573，P<0.01；r=0.630，P<0.01)。

2.6 大鼠血清GH水平與垂體GH免疫染色光密度值及陽性細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析

血清GH濃度與光密度值、陽性細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(分別為r=0.721，P<0.01；r=0.829，P<0.01)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)基本病機(jī)為腎虛、脾虛及血瘀，以腎虛為根本，血瘀為重要病因。補(bǔ)腎壯骨顆粒正是基于此種理論組方而成，主要包括鹿角膠、龜板膠、淫羊藿、生地、骨碎補(bǔ)、山藥、水蛭等成分。淫羊藿、鹿角膠、骨碎補(bǔ)可補(bǔ)腎強(qiáng)筋、益精填髓。龜板膠、生地可補(bǔ)腎精，益陰血。山藥可健脾和胃，養(yǎng)后天脾胃以充養(yǎng)先天之腎精。水蛭、三棱活血祛瘀止痛。前期研究發(fā)現(xiàn)臨床使用該方治療PMOP取得了公認(rèn)的良好效果，補(bǔ)腎壯骨顆?？梢栽黾覤MD及骨礦含量、降低骨折率、緩解疼痛及改善骨代謝情況，具有良好的成本-效果比[6,7]。補(bǔ)腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉泊笫笱錏2水平及股骨雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)和雌激素受體β(estrogen receptor β,ERβ)的表達(dá)，效果優(yōu)于E2治療[8]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血中GH、IGF-1和IGFBP3水平下降，與BMD、血清E2水平呈正相關(guān)[9,10]。因此，可以推測補(bǔ)腎壯骨顆粒的“補(bǔ)腎健骨”功效可能是經(jīng)由E2調(diào)控GH/IGF-1軸的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

IGF-1和GH是調(diào)節(jié)人一生骨平衡的主要因素，它們決定青春期前骨的生長長度、成熟和最大骨量的獲得，成年后則主要表現(xiàn)為對骨量的維持。大鼠成骨細(xì)胞系上表達(dá)GHR是GH發(fā)揮細(xì)胞增殖作用的一個(gè)重要因素[11]，GH結(jié)合成骨細(xì)胞上的GHR，從而促進(jìn)其有絲分裂。當(dāng)成骨細(xì)胞上的GHR缺乏時(shí)，IGF-1增殖和抗凋亡的作用減弱[12]。有研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞IGF-1R缺乏小鼠成骨細(xì)胞分化降低、骨密度下降，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，高齡野生型小鼠的IGF-1R較低齡的明顯降低[13]。成骨細(xì)胞上的IGF-1R與配體IGF-1結(jié)合，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，成骨細(xì)胞上IGF-1R基因敲除大鼠成骨細(xì)胞數(shù)量減少、骨重建率下降和松質(zhì)骨密度下降及微觀結(jié)構(gòu)異常[13]。可見，IGF-1/GH軸對骨代謝平衡維持的重大作用。

有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可促進(jìn)大鼠生長激素細(xì)胞的增殖，大鼠下丘腦中GH釋放因子神經(jīng)細(xì)胞、生長激素抑制素神經(jīng)細(xì)胞和垂體GH細(xì)胞均含有雌激素受體，此為E2影響GH水平提供了證據(jù)[14]。本研究顯示，OVX組大鼠血清GH及IGF-1濃度、脛骨組織GHR及IGF-1R水平、腦垂體光密度值、GH陽性細(xì)胞數(shù)和脊柱BMD均較SHAM組低，E2干預(yù)3個(gè)月及6個(gè)月后，以上指標(biāo)均有上升，與前研究中E2可影響GH細(xì)胞的增殖和分泌功能結(jié)論相符，同時(shí)也說明了E2治療骨質(zhì)疏松可能的作用機(jī)制。補(bǔ)腎壯骨顆粒組大鼠血清GH及IGF-1濃度、脛骨組織GHR及IGF-1R水平、腦垂體光密度值、GH陽性細(xì)胞數(shù)較OVX組上升，與E2組比較未見明顯差異。結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨顆粒可提高去卵巢大鼠血清E2水平[11]，考慮補(bǔ)腎壯骨顆粒可能通過提高血清E2表達(dá)水平調(diào)節(jié)GH/IGF-1的分泌。補(bǔ)腎壯骨顆粒干預(yù)3個(gè)月后股骨及脊柱BMD均所上升，與E2組干預(yù)3個(gè)月時(shí)只有脊柱BMD上升相比，說明在干預(yù)早期，對BMD的提高方面補(bǔ)腎壯骨顆粒較E2更具優(yōu)勢。干預(yù)6個(gè)月時(shí)，兩組藥物干預(yù)組的BMD未見明顯差異，說明兩種藥物長期療效相當(dāng)。因E2的副作用較大，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療方面，補(bǔ)腎壯骨顆?？赡芨鼮檫m合。相關(guān)性分析顯示，血清GH與垂體光密度值、GH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)，E2可能結(jié)合下丘腦GH釋放因子神經(jīng)細(xì)胞、GH抑制素神經(jīng)細(xì)胞和垂體GH細(xì)胞上的雌激素受體，促進(jìn)垂體GH細(xì)胞增殖和分泌GH。此外，相關(guān)性分析顯示股骨與脊柱BMD與血清GH、IGF-1呈正相關(guān)，再次驗(yàn)證了GH和IGF-1對骨代謝的正向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉泊笫笱錑H及IGF-1水平和其在脛骨中的受體表達(dá)水平、垂體GH細(xì)胞數(shù)量和光密度值以及BMD，骨密度的提高可能與補(bǔ)腎壯骨顆粒調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸的功能有關(guān)。