徐 云， 陳雪輝， 白立煒， 尹清風(fēng)， 馮春瑜， 張清貴△

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科一病區(qū)， 河南 衛(wèi)輝 453100； 2. 衛(wèi)輝市人民醫(yī)院內(nèi)科， 河南 衛(wèi)輝 453100)

糖尿病是一種糖脂代謝紊亂的慢性疾病，以2型糖尿病為主。機(jī)體血糖持續(xù)升高會產(chǎn)生炎癥應(yīng)激反應(yīng)，造成心血管并發(fā)癥，威脅患者的生命健康，目前臨床治療糖尿病的藥物主要是促進(jìn)胰島素分泌，增加胰島素的敏感性[1]。達(dá)格列凈是近年來開發(fā)的新型降糖藥物，是鈉-糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)的抑制劑，可抑制腎小球?qū)ζ咸烟堑闹匚?，通過促進(jìn)葡萄糖從尿液中排出，達(dá)到降低血糖的目的[2]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucosetransporter 2，GLUT2)與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucosetransporter 4，GLUT4)是葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中重要的蛋白，在機(jī)體葡萄糖動態(tài)平衡中扮演十分重要的角色，與2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)密切相關(guān)[3]。目前尚未見達(dá)格列凈對2型糖尿病GLUT2及GLUT4的影響，因此，本研究采用高脂飼料和一次性注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)建立2型糖尿病大鼠模型，并對糖尿病大鼠灌胃不同劑量的達(dá)格列凈進(jìn)行干預(yù)，通過檢測腎臟組織GLUT2及GLUT4基因表達(dá)探討達(dá)格列凈對2型糖尿病大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用，為臨床治療2型糖尿病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠均為6周齡的成年雄性大鼠，體重約200 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2007-007。RIPA細(xì)胞裂解液由上海申能博彩生物科技有限公司提供；ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒由Millipore公司提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒由Thermo公司提供；SDS-PAGE凝膠、電泳液、緩沖液均由上海鈺森生物技術(shù)有限公司提供；兔抗大鼠GLUT2抗體、兔抗大鼠GLUT4抗體由Abcam公司提供；Trizo總RNA 提取試劑及dNTP、rTaq酶均由Tokara公司提供；鏈脲佐菌素由美國Sigma公司提供；達(dá)格列凈由阿斯利康制藥有限公司提供。引物由上海博亞公司設(shè)計并合成。SOD、MDA、GSH-Px等試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 實驗分組

根據(jù)文獻(xiàn)[4]建立動物模型，將40只健康的SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常對照組(A組，6只)和糖尿病造模組(34只)。A組大鼠進(jìn)行普通飼料喂養(yǎng)4周，糖尿病造模組進(jìn)行高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，所有大鼠均進(jìn)食不禁水。喂養(yǎng)4周后，糖尿病造模組腹腔內(nèi)一次性注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，STZ的濃度為1%，A組大鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。3 d后尾靜脈采血檢測空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，造模大鼠以FBG含量≥16.7 mmol/L時視為造模成功；剔除空腹血糖<16.7 mmol/L的大鼠共7只，共造模成功27只大鼠。隨機(jī)選取24只糖尿病造模成功的大鼠將其隨機(jī)分為模型組(B組，生理鹽水)、達(dá)格列凈低劑量組(C組，0.75 mg/kg)、達(dá)格列凈中劑量組(D組，1.5 mg/kg)、達(dá)格列凈高劑量組(E組，3.0 mg/kg)。各組大鼠按上述劑量，每天灌胃1次，連續(xù)7周。

灌胃7周后，測定各組大鼠的體重，并將各組大鼠麻醉后，心臟取血，3 000 r/min離心15 min后取上清，檢測各組大鼠血糖含量、血清中糖化血紅蛋白及各生化指標(biāo)；取新鮮腎臟，一半放入4%多聚甲醛中固定，用于HE檢測腎臟病理變化；剩余腎臟置液氮中，并于-80℃保存，用于RT-qPCR和Western blot檢測。

1.3 腎臟組織HE染色

將固定好的大鼠腎臟組織制作石蠟切片，切片脫蠟后進(jìn)行蘇木精染色，然后再進(jìn)行伊紅染色，脫水封片后顯微鏡下觀察各組糖尿病大鼠腎組織的病理改變。

1.4 腎功能各指標(biāo)的檢測

使用全自動生化分析儀測定各組大鼠血清尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)和血清肌酐(serum creatinine，Scr)水平。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

取各組大鼠血清及腎臟組織，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用紫外可見分光光度計測定吸光值，計算超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)水平。

1.6 RT-qPCR檢測腎臟組織中GLUT2、GLUT4 mRNA的相對表達(dá)量

使用胰蛋白酶對腎臟組織進(jìn)行消化，洗滌后加入Trizol試劑提取腎臟組織的總RNA。將總RNA的濃度調(diào)節(jié)為1 μg/ml后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR擴(kuò)增目的基因，以β-actin 作為參照，使用2-△△Ct對GLUT2、GLUT4的mRNA進(jìn)行定量。PCR擴(kuò)增條件：94℃，5 min；94℃，45 s，55℃，45 s，72℃，1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

Tab. 1 PCR amplification primer sequences

1.7 Westren blot檢測GLUT2、GLUT4蛋白的相對表達(dá)量

將按1.2.5方法消化的腎臟組織離心棄上清，并加入RIPA裂解液，提取腎臟組織的總蛋白。使用蛋白定量試劑盒測定總提取蛋白的濃度，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上并使用脫脂奶粉將其封閉，然后加入一抗孵育過夜，洗膜后加入二抗，室溫振蕩孵育1 h，洗滌后進(jìn)行ECL顯色，曝光后進(jìn)行灰度值分析。使用GLUT2、GLUT4蛋白的光密度積分值與GAPDH的比值來表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的體重、FBG、HbA1c水平的變化

與A組比較，各組大鼠的體重明顯降低，F(xiàn)BG和HbA1c水平明顯升高(P均<0.05)；與B組比較，C組、D組和E組大鼠的體重明顯升高(P< 0.05)，F(xiàn)BG和HbA1c水平明顯降低(P<0.05)；與C組比較，D組和E組大鼠的體重明顯升高(P< 0.05)，F(xiàn)BG和HbA1c水平明顯降低(P<0.05，表2)。提示：本研究2型糖尿病大鼠均造模成功，而達(dá)格列凈可明顯降低2型糖尿病大鼠的FBG和HbA1c水平，并緩解大鼠因糖尿病造成的體重減輕，中劑量及高劑量的達(dá)格列凈治療2型糖尿病大鼠的療效較好。

Tab. 2 Changes of body weight, FBG and HbA1c levels of rats in each n=6)

2.2 各組糖尿病大鼠腎組織病理改變和腎功能指標(biāo)的變化

A組大鼠的腎組織中的腎小球、腎小管等結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)異常。B組大鼠的腎小囊腔出現(xiàn)狹窄，腎小球系膜區(qū)基質(zhì)出現(xiàn)明顯增生，腎小球出現(xiàn)硬化甚至纖維化，腎小管基底膜出現(xiàn)明顯增厚，甚至出現(xiàn)肥厚、纖維化等。C組大鼠腎小球及腎小管的病理變化與B組區(qū)別不明顯，D組、E組大鼠腎小球及腎小管的變化明顯較B組輕(圖1)。此外，本研究還檢測了各組大鼠給藥7周后的腎功能，與A組比較，各組大鼠的BUN、Scr均明顯升高(P<0.05)；與B組比較，各劑量組大鼠BUN、Scr均明顯降低，且E組在降低SUN和Ser的水平優(yōu)于C組和D組，(P<0.05，表3)。提示：達(dá)格列凈可改善糖尿病大鼠腎臟組織損傷，其中達(dá)格列凈高劑量效果最好。

Fig. 1 HE staining results of kidney of diabetic rats in each group after administration(Hematoxylin eosin ×100)

Tab. 3 Renal function of diabetic rats in each n=6)

2.3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

與A組比較，各組大鼠血清及腎臟SOD、GSH-PX水平明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與B組比較，各劑量組大鼠SOD、GSH-PX水平明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.05)，且E組在上調(diào)SOD、GSH-PX水平、降低MDA水平優(yōu)于C組和D組，見表4、5。提示：達(dá)格列凈可降低糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中達(dá)格列凈高劑量效果最好。

Tab. 4 Changes of serum oxidative stress indexes of rats in each n=6)

Tab. 5 Changes of kidney oxidative stress indexes in each n=6)

2.4 各組大鼠腎臟組織中GLUT2、GLUT4 mRNA水平與蛋白表達(dá)變化

與A組比較，B組大鼠腎臟組織中GLUT2、GLUT4 mRNA水平與蛋白表達(dá)明顯降低(P< 0.05)；與B組和C組比較，D組和E組大鼠腎臟組織中GLUT2、GLUT4 mRNA水平明顯升高(P均<0.05)；與B組比較，各劑量組大鼠腎臟組織中GLUT2、GLUT4蛋白表達(dá)均明顯升高(P均<0.05，圖2，表6)。

Tab. 6 Changes of GLUT2 and GLUT4 mRNA and protein expressions in kidney tissue of rats in each n=6)

Fig. 2 Expressions of GLUT2 and GLUT4 protein in kidney of rats in each group

3 討論

胰島B細(xì)胞功能障礙及胰島素抵抗是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制，而造成功能障礙的病理機(jī)制，主要是脂毒性及糖毒性[5-6]。葡萄糖代謝是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，需穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，但是葡萄糖是易溶于水的親水性物質(zhì)，而細(xì)胞膜是疏水性的雙層脂膜。因此，葡萄糖需要借助位于細(xì)胞膜內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUTs)通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。達(dá)格列凈是鈉-糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2的抑制劑，能抑制腎小球?qū)ζ咸烟堑闹匚?，但是其對GLUT2、GLUT4的影響尚未見相關(guān)報道。

本研究中通過應(yīng)用高糖高脂喂養(yǎng)，并聯(lián)合STZ誘導(dǎo)大鼠進(jìn)行2型糖尿病大鼠造模，經(jīng)過4周喂養(yǎng)后，獲得了穩(wěn)定的2型糖尿病大鼠模型，該模型具有與早期人2型糖尿病的發(fā)病特征及臨床表現(xiàn)。造模組大鼠FBG均>16.7 mmol/L，且FBG、HbA1c明顯較對照組升高，并伴有多飲、多食、多尿的癥狀，與人2型糖尿病類型相似。此外，與對照組比較，模型組大鼠的體重明顯降低。因此認(rèn)為本研究中2型糖尿病大鼠造模成功。達(dá)格列凈給藥7周后，各劑量組的2型糖尿病大鼠的體重明顯較模型組大鼠的體重增加，血清FBG、HbA1c、BUN、Scr水平明顯降低，中劑量和高劑量達(dá)格列凈還可改善大鼠腎組織的病變程度，提示了達(dá)格列凈具有較好的降糖效果及一定的腎臟保護(hù)作用，與臨床研究相似[7]。

目前發(fā)現(xiàn)的GLUTs有14個同種型，其中GLUT2、GLUT4屬于基礎(chǔ)性的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，與糖代謝密切相關(guān)[5]。GLUT2基因位于第3號染色體，由11個外顯子及1個內(nèi)含子構(gòu)成。GLUT2是對葡萄糖的親和力較低，但是轉(zhuǎn)運能力較高的轉(zhuǎn)移蛋白。有研究顯示，大鼠腎臟組織中GLUT2蛋白表達(dá)主要在大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿中[8]。Liad等[9]研究表明，GLUT2會影響從腎小管細(xì)胞重吸收或新合成的葡萄糖從基底外側(cè)流出；在高血糖狀態(tài)下，通過易化轉(zhuǎn)運體GLUT2的葡萄糖轉(zhuǎn)運改變可能會對腎功能和腎小管間質(zhì)改變產(chǎn)生負(fù)面影響。GLUT2能感應(yīng)周圍環(huán)境葡萄糖的濃度，當(dāng)血糖升高時，會增加對葡萄糖的轉(zhuǎn)運，使細(xì)胞內(nèi)外葡萄糖濃度達(dá)到平衡。據(jù)報道，糖尿病大鼠血糖增高，血漿胰島素水平降低，肝臟胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2, IRS2)和GLUT2蛋白表達(dá)下調(diào)，骨骼肌GLUT4蛋白表達(dá)下調(diào)；而經(jīng)治療后，血糖水平降低，胰島素水平提高，肝臟IRS2和GLUT2蛋白表達(dá)上調(diào)，骨骼肌GLUT4蛋白表達(dá)上調(diào)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的上調(diào)促進(jìn)了肝臟和骨骼肌的葡萄糖攝取[10]。有研究表明，腎臟GLUT4蛋白主要表達(dá)于腎小管，足細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也有少量表達(dá)[11]。GLUT4是胰島素刺激葡萄糖攝取的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白亞型，葡萄糖不能自由通過細(xì)胞膜，需要GLUT4的協(xié)助；在胰島素信號的刺激下，GLUT4轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上，促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，是直接影響葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的因子，直接影響血糖的調(diào)節(jié)[12-13]。張環(huán)[14]等認(rèn)為GLUT4對胰島素敏感至關(guān)重要，其表達(dá)下降或轉(zhuǎn)位受損與2型糖尿病病理相關(guān)。據(jù)報道[15-16]，當(dāng)GLUT2突變時，細(xì)胞對葡萄糖的敏感性明顯下降，肝臟對葡萄糖的攝取明顯減少；而GLUT4突變時，肌肉和脂肪均會出現(xiàn)葡萄糖攝取障礙。氧化應(yīng)激會干擾胰島素受體底物和胰島素受體的磷酸化水平，破壞胰島素信號傳導(dǎo)通路，從而加劇胰島素抵抗。相關(guān)研究還顯示[17]，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可通過絲/蘇氨酸蛋白激酶等信號分子的活性，抑制GLUT4的表達(dá)與轉(zhuǎn)位，干擾GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖運輸。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠腎組織和血清MDA水平升高，SOD、GSH-PX水平明顯降低，腎臟組織GLUT2、GLUT4表達(dá)明顯降低；大鼠給藥達(dá)格列凈后腎組織和血清MDA水平明顯較模型組降低，SOD、GSH-PX水平明顯高于模型組，且腎臟組織GLUT2、GLUT4表達(dá)明顯較模型組上調(diào)。提示達(dá)格列凈可明顯降低2型糖尿病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)GLUT2、GLUT4的表達(dá)。短期高血糖具有調(diào)節(jié)胰島素合成及葡萄糖轉(zhuǎn)化作用，但是長期高血糖會加重體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，對胰島B細(xì)胞以及其他器官、組織造成損傷，從而加重胰島素抵抗，造成GSIS受損[18-19]，并抑制了GLUT2、GLUT4的表達(dá)。達(dá)格列凈通過促進(jìn)血糖從尿液中排出而降低機(jī)體血糖，減輕了因高血糖而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕了氧化應(yīng)激損傷，上調(diào)GLUT2、GLUT4的表達(dá)，改善腎組織損傷，但如何調(diào)控GLUT2、GLUT4的表達(dá)具體機(jī)制尚無定論，可能與改善胰島素抵抗有關(guān)[20]，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，達(dá)格列凈具有較好的降糖效果，其可能的機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激及上調(diào)2型糖尿病大鼠GLUT2及GLUT4的表達(dá)有關(guān)。本研究的意義在于補(bǔ)充解釋了達(dá)格列凈發(fā)揮腎保護(hù)的相關(guān)機(jī)制，但不足之處未對GLUT2及GLUT4的表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行研究，仍需進(jìn)一步研究。