黃勉, 馮偉利, 植廣林, 楊子鵬, 左珂菁,楊曉穎, 陳絢姣, 袁浩, 袁子國(guó)*

(1.廣州動(dòng)物園, 廣州 510070; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 廣州 510642)

剛地弓形蟲是一種專性胞內(nèi)寄生原蟲，能感染包括人類、畜禽、鳥類在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游颷1-2]。妊娠動(dòng)物感染弓形蟲可垂直傳播至子代，形成先天性弓形蟲病，造成先天性缺陷或者死亡。動(dòng)物眼部發(fā)生感染時(shí)，若處理不當(dāng)，可造成嚴(yán)重的視力障礙[3-4]。弓形蟲病爆發(fā)也能帶來(lái)畜牧業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失，動(dòng)物弓形蟲感染的陽(yáng)性率為0.35%～85%，常呈現(xiàn)局部暴發(fā)流行[5]。近年來(lái)，豬弓形蟲病的相關(guān)報(bào)道日漸增多，在我國(guó)能夠自然感染弓形蟲的15種動(dòng)物中，豬的感染陽(yáng)性率最高。20世紀(jì)80年代，豬無(wú)名熱正是豬弓形蟲病引起。因弓形蟲病豬與豬瘟病豬癥狀類似，且多伴有混合感染或繼發(fā)感染，所以對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的影響較大[6]。棒狀體是寄生蟲的一種細(xì)胞亞器，蛋白組學(xué)研究表明,弓形蟲棒狀體共分泌30多種蛋白，根據(jù)在棒狀體內(nèi)的定位，這些蛋白可分為棒狀體基部蛋白(rhoptry proteins, ROPs)和棒狀體頸部蛋白(rhoptry neck proteins, RONs)兩類。ROPs是弓形蟲特異性蛋白，包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP16、ROP18等，可調(diào)控弓形蟲入侵、生長(zhǎng)、毒力及納蟲空泡(parasitophorous vacuole, PV)形成過程[7-9]。一般將ROPs分為ROP1和ROP2兩個(gè)蛋白家族。與ROP1蛋白家族相比，ROP2蛋白家族成員眾多，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP16以及ROP18。大部分ROP2家族成員能在蟲體入侵時(shí)定位于納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane, PVM)，起聯(lián)系宿主細(xì)胞和PV的作用，該類蛋白的絲氨酸、蘇氨酸激酶區(qū)發(fā)揮著重要作用[10]。ROP18是一種絲氨酸—蘇氨酸激酶，是弓形蟲毒力最重要的蛋白之一，被認(rèn)為是弓形蟲入侵的關(guān)鍵毒力因子[11-12]，ROP18基因位于染色體Ⅶa，接近編碼標(biāo)記CS3的基因[13-14]。研究表明，ROP18單獨(dú)或與ROP5組合分析可以有效地測(cè)定新型弓形蟲分離株對(duì)小鼠的毒力[15]。ROP16幾乎與ROP18同時(shí)被發(fā)現(xiàn)，亦為重要毒力因子[16-17]，其與宿主細(xì)胞內(nèi)STAT3、STAT6發(fā)生磷酸化，干擾宿主細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路傳導(dǎo)[16]。Yamamoto等[18]證實(shí)Ⅰ型弓形蟲ROP16缺陷株不能激活STAT3，從而導(dǎo)致IL-6和IL-12 p40上調(diào)。進(jìn)一步比較Ⅰ型和Ⅱ型弓形蟲蟲株ROP16間差異，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型蟲株激酶區(qū)存在一個(gè)關(guān)鍵氨基酸替代，導(dǎo)致其在胞內(nèi)STAT3的磷酸化水平有較大差異。綜上所述，棒狀體蛋白R(shí)OP16在蟲體入侵宿主、PV形成和毒力作用方面發(fā)揮著重要作用，是弓形蟲毒力調(diào)節(jié)因子，在弓形蟲逃避宿主的免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用[18]。由于弓形蟲Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和不同分離蟲株毒力存在差異，以Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株為參考，旨在研究不同來(lái)源蟲株TgROP16的序列遺傳演化分析，為了解我國(guó)弓形蟲的流行趨勢(shì)和遺傳進(jìn)化提供參考，也為弓形蟲通用免疫制劑的研制提供靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來(lái)源 弓形蟲ME49株、RH株、VEG株、PRU株均來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室；其他樣品來(lái)自廣東省某動(dòng)物園(表1)。

表1 弓形蟲株樣品來(lái)源Table 1 Details of T.gondii isolates used in the study

1.1.2主要試劑 1×PBS為HyClone公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、TaqDNA 聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Kit試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒、UNIQ-5柱式DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自TIANGEN生物技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為全式金公司產(chǎn)品。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1樣品DNA 的提取 將凍存的弓形蟲ME49株、VEG株、PRU株從液氮中取出，立即放入37 ℃的溫水中解凍，待完全融化之后腹腔注射健康的BALB/c小鼠。經(jīng)過3～5 d，小鼠出現(xiàn)被毛粗亂、弓背閉目、精神萎靡、腹部膨大等癥狀后脫頸處死，向腹腔注入1 mL 1×PBS沖洗腹腔，收集腹腔液。將抽取的腹腔液注入到空白小鼠腹腔內(nèi)，傳代3次，以保持弓形蟲的感染活力和毒力，收集腹腔液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品蟲株及環(huán)尾狐猴源、人源、豬源共4株弓形蟲臨床分離株使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取全基因組DNA。

1.2.2弓形蟲ROP16基因的擴(kuò)增及純化 根據(jù)弓形蟲ROP16(GenBank No. DQ116422.1)序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(F：5′-GAATT-CATGAAAGTGACCACGAAAG-3′，R：5′-GCGGC-CGCCTACATCCGATGTGAAGAAAGTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系25 μL：12.5 μL 2×TaqPlus Master Mix，8.5 μL dd H2O，上下游引物各2.5 μmol·L-1，DNA樣品2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 2.5 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。將PCR產(chǎn)物用10 g·L-1瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳，按試劑盒說(shuō)明回收純化目的基因。

1.2.3弓形蟲ROP16基因序列測(cè)定 將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建pMD18-ROP16重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞, 用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行PCR酶切和序列測(cè)定。

1.2.4限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(PCR-RFLP)分析 在0.5 mL EP管中分別加入dd H2O、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、Buffer、PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為20 μL，并根據(jù)各內(nèi)切酶適宜的反應(yīng)溫度水浴2 h。酶切產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察并成像。

1.2.5弓形蟲ROP16的序列分析及進(jìn)化樹的建立 用DNA Star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比較。用MEGA 5.05軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宿主ROP16基因的序列分析

用提取的9株樣品基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增均出現(xiàn)1條與預(yù)期片段(2 124 bp)大小一致的條帶。測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ROP16基因核苷酸序列的第68、242位等29個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異(表2)。9株序列堿基中A+T含量在46.94%～47.03%，其中27處出現(xiàn)C?T、A?G、A?C、G?T突變，2處發(fā)生A?T、G?C突變。

表2 不同弓形蟲樣品ROP16基因堿基序列比較結(jié)果Table 2 Nucleotide polymorphisms of the ROP16 gene from different T. gondii strains

2.2 不同來(lái)源的ROP16 PCR-RFLP分析

9個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ作用后均出現(xiàn)2條清晰的條帶，其中經(jīng)BamHⅠ酶切得到0.7 kb左右片段，經(jīng)HindⅢ酶切得到0.5 kb左右片段，經(jīng)XhoⅠ酶切得到0.6 kb左右片段(圖1)，該結(jié)果表明,不同分離株TgROP16的多態(tài)性無(wú)變化，作為弓形蟲分型的Marker基因應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用。

2.3 TgROP16序列分析及進(jìn)化樹的建立

9個(gè)樣品弓形蟲ROP16序列經(jīng)DNA Star進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)RH株和ME49株同源性最高,為100%，與豬源TgROP16同源性最低,為99.6%。環(huán)尾狐猴源TgROP16序列與豬源弓形蟲ROP16同源性最低,為99.4%，RH株最高和ME49株,均為99.8%。人源血TgROP16序列與PRU同源性最低,為99.5%。豬源TgROP16序列與VEG和人源分離株TgROP16差異性最大,為0.7,以上結(jié)果表明，弓形蟲在進(jìn)化的過程中雖然感染宿主的種類繁多，但TgROP16基因的變異小、保守性高，不宜作為蟲株進(jìn)化歷程和親緣關(guān)系的標(biāo)記分子。5株標(biāo)準(zhǔn)株和4株國(guó)內(nèi)分離株的ROP16序列進(jìn)化樹分析(圖2)顯示，最大似然比為-3 170.349 9。

3 討論

人和動(dòng)物的弓形蟲感染在世界范圍內(nèi)呈流行趨勢(shì)。人可以通過攝入含有弓形蟲組織包囊的未熟肉類，含有弓形蟲卵囊的其他食物，或飲水引起感染。而通過位點(diǎn)酶切、PCR-RFLP和微衛(wèi)星分型等分析手段，能夠?qū)谋泵篮蜌W洲分離到的絕大多數(shù)人源和動(dòng)物源性的弓形蟲蟲株劃入三個(gè)基因型譜系(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中。

ROP16也是由弓形蟲棒狀體分泌的一類絲氨酸——蘇氨酸激酶，在弓形蟲逃避宿主的免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。弓形蟲侵入宿主細(xì)胞時(shí)分泌并釋放ROP16，后者最后被細(xì)胞核定位信號(hào)(nuclear local-ization signals，NLS)運(yùn)輸至細(xì)胞核內(nèi)，在那里定位并發(fā)揮作用[20]。然而很少有針對(duì)不同樣品弓形蟲ROP16的序列分析。PCR-RFLP已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于弓形蟲基因分型[21]，多分子標(biāo)記的PCR-RFLP能更準(zhǔn)確的鑒別寄生蟲，但是需要大量的時(shí)間[22]。相對(duì)而言，單個(gè)分子標(biāo)記的PCR-RFLP更簡(jiǎn)便和省時(shí)。5株標(biāo)準(zhǔn)株和4株國(guó)內(nèi)分離株的弓形蟲ROP16序列均含有一個(gè)BamHⅠ酶切位點(diǎn)、一個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)和一個(gè)XhoⅠ酶切位點(diǎn)(圖2)，酶切結(jié)果表明，弓形蟲ROP16序列存在多態(tài)限制性位點(diǎn)。本研究用TgROP16作為PCR-RFLP的標(biāo)記分子，未能鑒別出傳統(tǒng)的弓形蟲Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

注：M為marker；1～9分別為弓形蟲 RH株、ME 49株、PRU株、PTG株、VEG株、環(huán)尾狐猴源分離株、人源分離株1、人源分離株2、豬源分離株。Note: M is marker; 1～9 indicate T. gondii RH strain, ME 49 strain, PRU strain, PTG strain, VEG strain, ring-tailed lemur, human blood 1, human blood 2, and pig isolate, respectively.圖1 不同分離株ROP16基因PCR片段酶切結(jié)果Fig.1 PCR-RFLP analysis of ROP16 fragments of T. gondii isolates using restriction endonucleases

圖2 不同分離株ROP16序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Molecular phylogenetic anaylsis based on ROP16 sequence

根據(jù)傳統(tǒng)的弓形蟲分型，弓形蟲Ⅰ型有RH株，ME49、PRU、PTG屬于弓形蟲Ⅱ型，VEG則是弓形蟲Ⅲ型。本文以TgROP16序列為基礎(chǔ)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PTG不能被劃分為弓形蟲Ⅱ型，與用弓形蟲ROP38序列做進(jìn)化樹結(jié)果一致[23]。環(huán)尾狐猴同VEG一樣被歸為弓形蟲Ⅲ型。人源血分離1和2分別被定義為弓形蟲Ⅲ型和Ⅱ型，與很多感染弱毒性弓形蟲株，癥狀不嚴(yán)重的病人一致。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)豬源弓形蟲ROP16與其他蟲株的同源性較低，是否為一個(gè)新的弓形蟲分離株，需要進(jìn)一步確認(rèn)。

本研究所有樣品擴(kuò)增出的弓形蟲ROP16序列全長(zhǎng)均為2 124 bp。9種樣品ROP16序列差異很小，其中核苷酸突變率為0～0.7%，低于弓形蟲ROP47、ROP20、ROP17等序列[24-25]；對(duì)比氨基酸發(fā)現(xiàn)有19處不同。之前已經(jīng)有許多關(guān)于弓形蟲ROP16的免疫保護(hù)性研究。Liu等[26]通過制備ROP16/GRA7 DNA疫苗評(píng)估了ROP16的免疫原性和反應(yīng)原性。Yuan等[27]和Pan等[28]發(fā)現(xiàn)ROP16能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫。這些結(jié)果表明：ROP16在不同分離株間非常保守，并能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是一個(gè)潛在的疫苗候選分子。