白春宏， 張文麗， 戶士忠

(1. 武警特色醫(yī)學(xué)中心骨科, 天津 300162； 2. 華北理工大學(xué)綜合測試分析中心, 唐山 063000； 3. 武警天津總隊第一支隊衛(wèi)生處， 天津 300222)

急性完全性脊髓損傷( spinal cord injury，SCI)患者腸道功能障礙嚴(yán)重影響患者身心健康，尤其腸道細菌移位和內(nèi)毒素血癥的出現(xiàn)會導(dǎo)致膿毒血癥、敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至出現(xiàn)多器官功能衰竭乃至死亡。Bai 等通過電刺激兔骶3 神經(jīng)根發(fā)現(xiàn)，該電刺激可以改善兔子的腸道癥狀,減輕菌群移位、內(nèi)毒素血癥[1]。完整的腸道屏障功能主要包括機械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障，其中免疫屏障功能平時維持腸內(nèi)、外微生物平衡，對抵抗細菌移位和內(nèi)毒素血癥，以及它們所造成的繼發(fā)損傷起到關(guān)鍵作用[2]。有關(guān)骶神經(jīng)刺激( sacral nerve stimulation，SNS) 對SCI 腸道免疫屏障功能的具體保護作用仍未被闡明。所以本實驗旨在初步探討SNS 對SCI 大鼠腸道免疫屏障功能的保護作用，為其在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 截癱模型建立和電刺激實施

大鼠麻醉后定位T6棘突，刮毛、消毒。手術(shù)暴露脊髓，F(xiàn)ehlings法98 g動脈瘤夾橫行鉗夾約l min，以雙下肢抽搐停止，運動、感覺誘發(fā)電位評價完全離斷情況。定位右側(cè)骶3神經(jīng)孔，脫毛、消毒，置人電極，電刺激尾部肌肉收縮確定植入效果，SCI 2 h后電刺激，參數(shù)為：電壓4 V，波寬210 μs，頻率15 Hz，刺激10 s，間歇20 s。每次持續(xù)10 min，間歇10 min，共2 h。早8：00-10：00，晚6：00-8：00兩次(前期實驗確認)。

1.2 實驗分組及標(biāo)本采集

按隨機數(shù)字表法分為正常組(Sham group，SG=8只)、脊髓損傷組(Control group，CG=24只)和骶神經(jīng)電刺激組(Experimental group，EG=24只)。CG(24、48和72 h，8只/組)和EG (24、48和72 h，8只/組)。

1.3 腸粘膜形態(tài)學(xué)觀察

消毒后剖腹，取小腸組織(距離盲腸約10 cm)，常規(guī)處理后分別進行光鏡和透射電鏡觀察。

1.4 Western blot檢測小腸組織中鋅指蛋白A20、NOD2和CD68蛋白表達量

Anti-鋅指蛋白A20、Anti-NOD2抗體購自美國Sigma公司， Anti-CD68抗體、Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG購自英國Abcam 公司，以β-actin 為內(nèi)參。用 image J 圖像分析軟件，根據(jù)光密度定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腸道形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 光鏡 SG小腸黏膜完整、形態(tài)正常；CG黏膜形態(tài)破壞隨時間逐漸加重，24 h發(fā)現(xiàn)(Peyer patch，PP)濾泡相關(guān)上皮破壞，使腸腔和上皮下穹隆貫通；72 h黏膜下水腫、淤血，大量炎性細胞浸潤，腸絨毛破壞，上皮細胞壞死，大量滲出。EG黏膜形態(tài)也有不同程度破壞，72 h黏膜下血管輕度充血，少量滲出物，少量炎性細胞浸潤(圖1)。

2.1.2 電鏡 SG細胞間緊密連接、中間連接和橋粒正常，小腸微絨毛排列整齊；CG黏膜上皮出現(xiàn)不同程度細胞水腫，細胞間隙增寬。72 h黏膜上皮細胞水腫嚴(yán)重，部分細胞壞死，細胞間隙明顯增寬,微絨毛水腫、折斷并脫落。部分腸黏膜上皮細胞崩解破裂，細胞外細菌和雜質(zhì)進入腸黏膜上皮細胞;細胞外細菌和雜質(zhì)穿經(jīng)M細胞并同時沿細胞軸經(jīng)細胞旁緊密連接處進入黏膜下組織;細菌進入血管，和紅細胞共同在微血管內(nèi)循環(huán)。EG上述損傷較輕，72 h黏膜上皮細胞水腫，細胞間隙略增寬，微絨毛變疏松(圖2，3)。

Fig. 2 Intestinal morphology under transmission electron microscope in each group

Fig. 3 Electron microscopic observation of bacteria and impurities penetrating the intestinal mucosal barrier

2.2 腸組織鋅指蛋白A20、NOD2和CD68表達

鋅指蛋白A20：與SG相比，CG各小組A20表達均明顯降低(P<0.01)；與SG、CG相比，EG各小組A20的表達均明顯升高(P<0.01)。A20作為機體內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)控的內(nèi)源性蛋白，其表達量增加，提示機體內(nèi)源性抗炎保護作用得到增強。本實驗CG組減少，提示SCI小腸缺少鋅指蛋白A20保護，SNS后明顯增加，說明SNS可刺激鋅指蛋白A20產(chǎn)生，減少腸黏膜炎癥反應(yīng)、氧化反應(yīng)并提供內(nèi)源性保護。

NOD2：與SG比，CG各組NOD2的表達均明顯升高(24 h、72 hP<0.05；48 hP<0.01)；與CG比，EG 48 h、72 h NOD2的表達均明顯降低( 48 hP< 0.01,72 hP<0.05);與SG相比，EG各組NOD2表達均無統(tǒng)計學(xué)意義。NOD2蛋白作為一種細胞內(nèi)膜識別受體，可通過其下游靶基因表達產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。其表達量增加，提示機體有抗原入侵，發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后NOD2表達下降接近SG水平，證明炎癥反應(yīng)減輕。

CD68：與SG、EG比，CG各組CD68的表達均明顯升高(P<0.01)；與SG相比，EG 24 h、48 h組NOD2表達明顯升高(P<0.01),72 h組無統(tǒng)計學(xué)意義。CD68蛋白作為一種巨噬細胞標(biāo)記性分子，其表達量增加，提示巨噬細胞數(shù)量增加并活躍，機體發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后炎癥反應(yīng)減輕(圖4，表1)。

Fig. 4 The expressions of A20, NOD2, and CD68 in small intestine of EG, SG and CG

Tab. 1 The expression levels of A20, NOD2, and CD68 in small intestine

3 討論

腸道免疫系統(tǒng)主要由腸黏膜上皮的免疫相關(guān)組織(如PP、腸系膜淋巴結(jié))、細胞(如樹突細胞、巨噬細胞、T細胞及B細胞等)和分子(抗菌肽、免疫球蛋白、融酶等)組成，構(gòu)成免疫屏障，及時識別外來微生物抗原、食物抗原以及自身異?？乖?，誘導(dǎo)出局部及全身免疫應(yīng)答反應(yīng),維持腸道動態(tài)平衡[3]。小腸黏膜免疫屏障包括黏膜層及黏膜下固有層內(nèi)的局部淋巴細胞，構(gòu)成黏膜相關(guān)淋巴組織，結(jié)構(gòu)上分為免疫誘導(dǎo)部分和免疫效應(yīng)部分。比如位于黏膜誘導(dǎo)部位的M細胞[4]攝取抗原，呈遞給巨噬細胞、B細胞、樹突細胞和肥大細胞[5]，這些細胞再對抗原進行加工處理；或由上皮細胞呈遞給B細胞和T細胞。樹突狀細胞還可以打開腸道上皮的緊密連接直接進入腸腔吞噬病原體，激活黏膜免疫系統(tǒng)的幼稚T細胞。淋巴細胞和抗原發(fā)生作用后，呈遞抗原給腸道淋巴結(jié)，再進入全身循環(huán)，然后再回到腸道，稱之為歸巢。免疫屏障功能的狀態(tài)關(guān)乎腸道局部和全身炎癥反應(yīng)的程度，也是本次研究的重點。

完整的腸上皮細胞選擇通透性能夠有效阻止細菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過腸黏膜組織進入血液。腸上皮細胞間通道是封閉的，這種生理功能是由相鄰上皮細胞之間的連接復(fù)合體完成的，其中緊密連接起著主要的作用。腸道蠕動是腸道機械屏障的另一重要組成部分[6]。正常腸道菌群構(gòu)成腸道的非特異性免疫屏障,形成穩(wěn)態(tài)[7]。當(dāng)腸道細菌數(shù)量、種類或者位置發(fā)生變化時，腸道的穩(wěn)態(tài)發(fā)生破壞，腸道免疫系統(tǒng)就會啟動來糾正以維持平衡[8,9]。腸道機械屏障一旦破壞，腸道通透性會增加[10]。腸黏膜上皮的完整性，也是微生物和免疫屏障之間的壁壘[11]。當(dāng)SCI時，腸道功能紊亂，蠕動減慢，腸管積氣、積便，大量細菌繁殖。同時，可直接或間斷破壞腸道械屏障，細菌通過腸黏膜上皮細胞和其間的緊密連接組成機械屏障而進入黏膜下組織[12]，腸黏膜上皮免疫相關(guān)組織就會發(fā)揮作用，形成激烈的局部炎癥反應(yīng)。尤其巨噬細胞和樹突細胞等在PP上皮穹隆的下面，非常適合監(jiān)測進入PP的微生物，導(dǎo)致大量的免疫細胞聚集并把細菌帶入循環(huán)系統(tǒng)。內(nèi)毒素再次打擊腸黏膜形成繼發(fā)性損傷，免疫屏障功能從而也遭到破壞，進而形成惡性循環(huán)。本實驗發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后腸道黏膜開始出現(xiàn)黏膜下血管充血，炎性細胞浸潤，黏膜上皮細胞輕度水腫，細胞間隙略增寬。24 h發(fā)現(xiàn)PP濾泡相關(guān)上皮破壞，使腸腔和上皮下穹隆貫通；后期甚至出現(xiàn)腸絨毛破壞，上皮細胞壞死，大量滲出。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CG72 h組黏膜上皮細胞水腫嚴(yán)重，部分細胞壞死，細胞間隙明顯增寬,微絨毛水腫、折斷并脫落。嚴(yán)重區(qū)域有細胞崩解破裂，細胞外細菌和雜質(zhì)進入腸黏膜上皮細胞;細胞外細菌和雜質(zhì)穿經(jīng)M細胞并同時沿細胞軸經(jīng)細胞旁緊密連接處進入黏膜下組織;細菌進入血管，和紅細胞共同在微血管內(nèi)循環(huán)。而EG組雖然也有不同程度損傷，但較對照組明顯減輕。

巨噬細胞在維持腸黏膜免疫平衡過程中起著關(guān)鍵作用[13]。巨噬細胞標(biāo)記性分子CD68可用于檢測巨噬細胞的分布規(guī)律和數(shù)量[14]。CD68可激活體內(nèi)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，造成NF-KB等活化，啟動多種炎癥細胞因子基因(如IL-1b, TNF, IL-12, and IL-23等)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，加強體內(nèi)炎癥反應(yīng)[15]。本實現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：與SG、EG比，CG各組CD68的表達均明顯升高(P<0.01)；與SG相比，EG24h、48h組NOD2表達明顯升高(P<0.01),72 h組無統(tǒng)計學(xué)意義。提示巨噬細胞數(shù)量增多，比較活躍，黏膜局部發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)[16]。EG各組CD68的表達均減少，到72 h組減少到和SG組無統(tǒng)計學(xué)差異，證明SNS后，黏膜下炎癥反應(yīng)減輕。

鋅指蛋白A20是炎癥時NF-KB活化介導(dǎo)并自體合成的一種強有效抑制NF-KB的炎癥反應(yīng)特異性調(diào)控蛋白[17]，降低炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-β等) 釋放，調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)和凋亡抑制,通過抗炎癥反應(yīng)和抗氧化反應(yīng)，維持機體免疫能力以達到機能平衡[18]；同時調(diào)整多核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞以提高內(nèi)在免疫功能[19]。創(chuàng)傷感染的早期A20表達增加是機體重要的內(nèi)源性抗炎保護效應(yīng)機制。本實驗發(fā)現(xiàn)：與SG相比，CG各小組A20表達均明顯降低(P<0.01)；與SG、CG相比，EG各小組A20的表達均明顯升高(P<0.01)。A20作為機體內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)控的內(nèi)源性蛋白，其表達量增加，提示機體內(nèi)源性抗炎保護作用得到增強。本實驗CG組減少，提示SCI小腸缺少鋅指蛋白A20保護，SNS后明顯增加，說明SNS可刺激鋅指蛋白A20產(chǎn)生，減少腸黏膜炎癥反應(yīng)、氧化反應(yīng)并提供內(nèi)源性保護。

NOD2是凋亡調(diào)節(jié)因子，NOD2突變，改變了NF-κB的信號反應(yīng)，導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。NOD2蛋白是一種細胞內(nèi)模式識別受體，可識別細菌細胞壁的肽聚糖及其裂解產(chǎn)物胞壁酰二肽，廣泛參與宿主對病原體的免疫應(yīng)答，是聯(lián)系天然免疫與特異性免疫的重要橋梁。NOD2在腸道上皮細胞中的表達較低，可能是機體對腸道正常微生物的一種保護機制[20]。外源微生物入侵時，機體可能通過其它模式識別受體激活NF-κB，上調(diào)NOD2的表達，啟動其介導(dǎo)的信號通路。正常情況下，NOD2可通過其下游靶基因表達產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。如NOD2的下游靶目標(biāo)黏膜免疫排斥因子DMBT1，可防止細菌侵入小腸上皮細胞。NOD2也可通過調(diào)控腸道Paneth細胞釋放防御素和抗菌肽來維持腸道黏膜正常的屏障功能[21]，或者與CD147形成CD147-NOD2復(fù)合物降低CD147的活性，因為CD147高表達會促進李斯特菌侵入上皮細胞。NOD2基因突變或功能缺陷導(dǎo)致腸道對病原體容忍度增加[22]，因此，腸道免疫屏障受損?？赡苁怯捎诳咕谋磉_量減少、防御素表達缺乏調(diào)節(jié)、腸黏膜滲透性增加等原因，使得腸道殺菌能力減弱、細菌易于侵入上皮細胞。本實現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：與SG比，CG各組NOD2的表達均升高(24 h、72 hP<0.05；48 hP< 0.01)；與CG比，EG48 h、72 h NOD2的表達均降低(48 hP<0.01,72 hP<0.05);與SG相比，EG各組NOD2表達均無統(tǒng)計學(xué)意義。NOD2蛋白作為一種細胞內(nèi)膜識別受體，可通過其下游靶基因表達產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。其表達量增加，提示機體有抗原入侵，發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后NOD2表達下降接近SG水平，證明炎癥反應(yīng)減輕。

總之，SNS能較好促進腸道蠕動，保護腸黏膜機械屏障，減少病原體入侵，減輕炎癥反應(yīng)并加強內(nèi)源性保護，改善腸黏膜免疫屏障功能。為改善腸道功能，預(yù)防截癱后內(nèi)毒素血癥和腸道菌群移位感染的發(fā)生提供了一種有效的選擇。