阿如娜,劉 科,陳 灰,曹金山,賀鵬飛 (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018;2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特010018)

高產(chǎn)奶牛泌乳早期由于能量負(fù)平衡導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降,奶牛分娩后生殖道細(xì)菌易于上行感染導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎。每年我國分娩母牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率高達(dá)30%～40%,患牛人工授精次數(shù)增加,配種和受孕間隔延長,妊娠率、受孕率降低致使治療費(fèi)用及奶牛淘汰率增加,給我國奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。當(dāng)前對(duì)于子宮內(nèi)膜炎治療主要使用抗生素及前列腺素類藥物,但由于抗生素藥物殘留,前列腺素對(duì)無活躍黃體奶牛療效尚無定論且前列腺素頻繁使用擾亂奶牛發(fā)情周期,因此開發(fā)新型抗菌藥及抗炎藥成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。α7-n ACh R 廣泛的存在于神經(jīng)細(xì)胞及非神經(jīng)細(xì)胞,如星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)前細(xì)胞及其他內(nèi)皮細(xì)胞上[2]。最新的研究進(jìn)展表明,激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的α7-n AChR 可以調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng),并且可能成為治療一系列慢性難治性炎癥疾病及炎性細(xì)胞因子相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)。α7-n ACh R 由同源的α7 亞基組成的五聚體,其對(duì)Ca2＋具有高度通透性,而作為第二信使的Ca2＋在α7-n ACh R 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)中具有重要作用[3]。激活α7-n ACh R 可以通過胞內(nèi)Ca2＋信號(hào)誘導(dǎo)PKA 依賴的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-1(ERK1)和ERK2的活化[4-5]、抑制IκB的磷酸化來抑制NFκB的活化,下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)及抑制促炎因子釋放發(fā)揮抗炎作用[6-7];同時(shí),激活α7-n ACh R 可以募集jak2蛋白形成異源二聚體,并觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(stat3)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB 與DNA的結(jié)合,增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)的活性參與抗炎效應(yīng)[8]。在膠質(zhì)細(xì)胞中,α7-n ACh R 可以上調(diào)環(huán)氧合酶2(cox-2)的活性促進(jìn)前列腺素E2(PGE2)合成發(fā)揮抗炎作用[9]。

目前尚無子宮內(nèi)膜α7-n ACh R 參與炎癥調(diào)控的研究報(bào)道。課題組前期通過RT-qPCR 檢測到奶牛子宮內(nèi)膜組織α7-n AChR 表達(dá),但其是否參與炎癥調(diào)控尚不清楚。因此,本研究擬通過體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織并建立LPS 炎癥模型,應(yīng)用α7-n AChR 特異性激動(dòng)劑及抑制劑,使用RT-qPCR 檢測炎癥細(xì)胞因子il-1β、il-6、il-8、tnf-α、cox-2及mpges-1 m RNA 表達(dá)水平變化,初步闡明奶牛子宮內(nèi)膜組織α7-n ACh R 的抗炎效應(yīng),為奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療及新藥開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品胎牛血清(Inc,中國),DMEM/F-12(Gibco,美國),青霉素(Gibco,美國),鏈霉素(Gibco,美國),兩性霉素B(GENERAY,中國),PNU-282987(MCE 生物公司,美國),甲基牛扁堿(MLA,MCE 生物公司,美國),脂多糖(LPS,Sigma,美國),AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit(Axygen Scientific,美國),SYBR Premix ExTaqⅡ(Ta KaRa,日本),Primer Script RT Master Mix(Ta KaRa,日本),引物均由Invitrogen公司合成。

1.2 試驗(yàn)儀器高速低溫離心機(jī),德國Beckman公司;高壓自動(dòng)蒸汽滅菌鍋,日本Hirayama公司;低速臺(tái)式離心機(jī),中國上海安亭公司;超純水儀,中國Biotech公司;－80℃低溫冰箱,德國Thermo公司;－20℃低溫冰箱,中國美菱公司;酶標(biāo)儀,美國Bio-TEK 公司;制冰機(jī),日本Panasonic公司;ABIVii ATM7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀,德國Life公司。

1.3 試驗(yàn)組織健康奶牛雙側(cè)子宮角采自內(nèi)蒙古呼和浩特市某屠宰場,樣品保存在無菌PBS緩沖液中,1 h內(nèi)送回試驗(yàn)室,通過肉眼觀察卵泡大小及黃體形態(tài),選取發(fā)情前期的雙側(cè)子宮角部位組織進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.4 組織培養(yǎng)將新鮮組織用PBS(含100 IU/m L雙抗,2.5 mg/L兩性霉素B)沖洗3遍,4℃保存1 h;無菌條件下,縱向剖開子宮角用彎剪刀和眼科鑷子取下將含有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的子宮內(nèi)膜組織并剪成直徑大小約為2 mm 的碎塊,放入含有5 m L 培養(yǎng)液(DEME/F-12,20%胎牛血清,100 IU/m L 雙抗,2.5 mg/L兩性霉素B)的六孔板中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(5%CO2、37℃)培養(yǎng),每天更換1次培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)5 d直至組織生長穩(wěn)定之后,將培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12 h,再換成含血清無雙抗的培養(yǎng)基,進(jìn)行藥物處理8和12 h收集組織。

1.5 LPS作用時(shí)間篩選終質(zhì)量濃度1 mg/L LPS刺激離體奶牛子宮內(nèi)膜組織,分別培養(yǎng)2,4,8,12,24 h,應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù)評(píng)估組織中的il-6 m RNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 藥物處理把培養(yǎng)5 d的子宮內(nèi)膜組織的培養(yǎng)基換成無雙抗的的DMEM/F-12培養(yǎng)基,試驗(yàn)分為16組,分別為空白對(duì)照組、LPS組、LPS與α7n AChR激動(dòng)劑組(PUN-282987 5,10,15 mmol/L),激動(dòng)劑試驗(yàn)組分別設(shè)立5 mmol/L MLA 抑制劑組,每組6個(gè)重復(fù),分別培養(yǎng)8和12 h,收集樣品,進(jìn)行炎性細(xì)胞因子檢測。

1.7 總RNA提取及cDNA合成將各試驗(yàn)組組織稱取40 mg,應(yīng)用組織勻漿機(jī)進(jìn)行研磨,按照說明書提供的方法使用總RNA 提取試劑盒提取組織總RNA,通過酶標(biāo)儀檢測總 RNA 的吸光度,D260 nm/D280 nm 值為1.9～2.0,質(zhì)量濃度在500～1 000 mg/L可進(jìn)行下一步試驗(yàn);將總RNA 質(zhì)量濃度調(diào)整到500 mg/L,然后按照說明書提供的方法使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.8 RT-qPCR 檢測炎性細(xì)胞因子RT-qPCR 反應(yīng)體系為:SYBR Premix ExTaqⅡ10.0μL,上游引物0.4μL,下游引物0.4μL,Rox 0.4μL,cDNA 2.0μL,水6.8μL,總計(jì)20.0μL;反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,58℃退火34 s;72℃延伸30 s,共40 個(gè)循環(huán)。RT-qPCR 反應(yīng)中所用的引物序列見表1。

表1 基因序列

1.9 數(shù)據(jù)處理采用2－ΔΔC t法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量;使用SPSS15.0軟件經(jīng)ANOVA 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果表用±s x表示并用Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 奶牛子宮內(nèi)膜組織LPS炎癥模型時(shí)間優(yōu)化由圖1可知,LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜組織之后il-6 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平在8和12 h最高,并在12 h達(dá)峰值,因此本研究選擇8和12 h作為組織LPS刺激炎癥模型作用時(shí)間。

圖1 LPS不同作用時(shí)間il-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平 字母相異表示差異顯著(P＜0.05)。下同

2.2 奶牛子宮內(nèi)膜組織α7-n AChR 介導(dǎo)的LPS炎癥模型炎性細(xì)胞因子表達(dá)由圖2可知,LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織8 h能夠顯著上調(diào)促炎細(xì)胞因子il-1β、il-6和tnf-α m RNA 的 表 達(dá),α7-n ACh R 特 異性激動(dòng)劑PNU-282987在5,10,15 mmol/L均能顯著抑制細(xì)胞因子的表達(dá),α7-n ACh R 特異性拮抗劑MLA 能夠明顯抑制PNU-282987的作用。

圖2 LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜組織8 h及不同濃度藥物處理il-1β、il-6和tnf-αmRNA 相對(duì)表達(dá)水平 A.il-1βmRNA 相對(duì)表達(dá)水平;B.il-6 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平;C.tnf-αm RNA 相對(duì)表達(dá)水平;1.CON;2.LPS;3.LPS＋5 mmol/L PNU-282987;4.LPS＋5 mmol/L PNU-282987＋5 mmol/L MLA;5.LPS＋10 mmol/L PNU-282987;6.LPS＋10 mmol/L PNU-282987＋5 mmol/L MLA;7.LPS＋15 mmol/L PNU-282987;8.LPS＋15 mmol/L PNU-282987＋5 mmol/L MLA。下同

由圖3A 可知,LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織8 h能夠明顯上調(diào)炎癥趨化細(xì)胞因子il-8 m RNA 的表達(dá),α7-n AChR 特異性激動(dòng)劑PNU-282987在5,10,15 mmol/L 均能顯著抑制il-8 m RNA 的表達(dá),α7-n AChR 特異性拮抗劑MLA 能夠明顯抑制PNU-282987 的 作 用;cox-2 和mpges-1 在PNU-282987在5和10 mmol/L濃度下與il-8具有相同趨勢,但在15 mmol/L 濃度下的作用雖然明顯低于LPS組,但MLA 不能明顯逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)(圖3B,C)。

圖3 LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜組織8 h及不同濃度藥物處理il-8、cox-2和mpges-1 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平 A.il-8 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平;B.cox-2 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平;C.mpges-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平

由圖4可知,LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h能夠明顯上調(diào)促炎細(xì)胞因子il-1β、il-6和tnf-αm RNA 的 表 達(dá),α7-n ACh R 特 異 性 激 動(dòng) 劑PNU-282987在5,10,15 mmol/L 均能顯著抑制細(xì)胞因子的表達(dá),PNU-282987在15 mmol/L時(shí)il-6和tnf-α的表達(dá)量未被相應(yīng)的拮抗劑顯著抑制,其他劑量下的PNU-282987均被α7-n ACh R 拮抗劑MLA 明顯抑制,其他組α7-n ACh R 特異性拮抗劑MLA 均能明顯抑制PNU-282987的作用。

圖4 LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h及不同濃度藥物處理il-1β、il-6和tnf-αm RNA 相對(duì)表達(dá)水平 A.il-1βm RNA 相對(duì)表達(dá)水平;B.il-6 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平;C.tnf-αmRNA 相對(duì)表達(dá)水平

由圖5可知,LPS刺激奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h能夠促進(jìn)趨化性細(xì)胞因子il-8的表達(dá)量,α7-n ACh R特異性激動(dòng)劑PNU-282987在5,10,15 mmol/L均能顯著抑制該因子的表達(dá),除15 mmol/L 組外,α7-n ACh R 特異性拮抗劑MLA 能夠明顯抑制PNU-282987的作用;LPS可明顯上調(diào)cox-2 和mpges-1 m RNA 表達(dá),激動(dòng)劑在5,10,15 mmol/L 均能顯著抑制cox-2和mpges-1的表達(dá),MLA 能夠明顯抑制激動(dòng)劑上調(diào)cox-2和5 mmol/L mpges-1效應(yīng)。

3 討論

炎癥對(duì)機(jī)體防御、組織再生及代謝調(diào)節(jié)具有重要作用,但過度的炎癥反應(yīng)則引起組織損傷。奶牛子宮內(nèi)膜炎是產(chǎn)后奶牛高發(fā)疾病,革蘭陰性菌感染是產(chǎn)后奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病因,革蘭陰性菌脂多糖(LPS)可被子宮上皮細(xì)胞模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別,從而激活胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子的分泌促進(jìn)炎癥發(fā)生[10]。當(dāng)前對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎防治措施主要是應(yīng)用抗菌藥及激素。由于細(xì)菌耐藥性及藥物殘留,前列腺素類藥物抗炎治療在無黃體期效果存在爭議,因此探尋新的抗炎靶位及開發(fā)新型藥物是當(dāng)前防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究熱點(diǎn)。根據(jù)目前研究結(jié)果,無論天然藥物還是微生物制劑都尚不能達(dá)到滿意的臨床效果,因此開發(fā)新型抗菌、抗炎藥成為奶牛子宮內(nèi)膜炎防治的研究重點(diǎn)[11]?！盁焿A抗炎通路”在免疫反應(yīng)及炎癥級(jí)聯(lián)中發(fā)揮重要作用,α7-n ACh R 在膽堿能抗炎通路中起到核心作用,激動(dòng)α7-n AChR 可以顯著抑制炎性細(xì)胞因子tnf-α、il-1β、il-6和il-18 的產(chǎn)生,是炎癥疾病治療的潛在靶點(diǎn)[12-13]。

圖5 LPS作用奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h及不同濃度藥物處理il-8、cox-2和mpges-1 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平 A.il-8 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平;B.cox-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平;C.mpges-1 m RNA 相對(duì)表達(dá)水平

Il-6是評(píng)價(jià)炎癥模型常用的細(xì)胞因子[14],由圖1可知,LPS處理奶牛子宮內(nèi)膜組織8和12 h il-6 m RNA 的相對(duì)表達(dá)量最高,且12 h達(dá)峰值,因此本研究選擇8和12 h作為LPS處理組織時(shí)間點(diǎn)。

在機(jī)體受到感染和損傷時(shí),先天性免疫系統(tǒng)被激活并釋放促炎性細(xì)胞因子如tnf-α、il-1β、il-6,它們引發(fā)的炎癥反應(yīng)在控制感染和促進(jìn)組織修復(fù)中起重要的作用[15]。本研究結(jié)果表明,PNU-282987作為α7-n ACh R 特異性激動(dòng)劑能夠抑制由LPS致炎的奶牛子宮內(nèi)膜組織分泌的炎性細(xì)胞因子tnf-α、il-1β、il-6的表達(dá),而MLA 能抑制PNU-282987的作用從而上調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。Il-8屬于CXC 趨化因子亞家族,是激活和趨化中性粒細(xì)胞的主要趨化因子,主要趨化中性粒細(xì)胞遷移至血管內(nèi)皮,促進(jìn)其在炎癥部位的聚集,促進(jìn)內(nèi)皮炎癥的發(fā)展,加重內(nèi)皮損傷[15-20]。LPS能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等合成分泌il-8[21-24]。在本試驗(yàn)中,PNU-282987能下調(diào)奶牛子宮內(nèi)膜組織分泌的趨化性細(xì)胞因子的表達(dá),而MLA 可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。上述結(jié)果表明,奶牛子宮內(nèi)膜α7-n ACh R 參與炎癥反應(yīng),激動(dòng)α7-n ACh R 具有抗炎效應(yīng)。

Cox-2為誘導(dǎo)型酶,在炎癥反應(yīng)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中大量表達(dá),促進(jìn)PGE2的生成而參與炎癥反應(yīng)[25]。Mpges-1 與炎癥關(guān)系非常密切,其在體外可被致炎因子如LPS、il-1β誘導(dǎo)而大量表達(dá)[26]。PGE2是一類在體內(nèi)廣泛存在的脂類調(diào)節(jié)因子,也是炎癥反應(yīng)中疼痛和發(fā)熱的介質(zhì),參與炎癥的病理、生理過程[27]。Mpges-1 是PGE2合成的終末限速酶,與cox-2 一起參與PGE2的合成[28],mpges-1水平的升高與cox-2表達(dá)和PGE2生成量的增加呈正相關(guān)。在本研究中,單獨(dú)給予LPS誘導(dǎo)炎癥后能夠促進(jìn)cox-2 和mpges-1 的表達(dá),PNU-282987同時(shí)給藥時(shí)能夠明顯抑制該效應(yīng),但在15 mmol/L試驗(yàn)組中,MLA 并不能完全逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑效應(yīng),或許與拮抗劑劑量不足有關(guān),仍需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。上述結(jié)果表明,奶牛子宮內(nèi)膜組織α7-n ACh R 可能通過調(diào)控PGE2的合成參與炎癥反應(yīng)。