牛美容,李法財(cái),謝世臣,聶蘭碧,朱興全,趙光輝? (.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌700;.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)/甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046)

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,能夠引起人獸共患的弓形蟲病。孕婦在懷孕期間感染弓形蟲后,可通過垂直傳播引起胎兒腦炎、視網(wǎng)膜炎癥甚至更嚴(yán)重的后果[1-2]。弓形蟲的宿主范圍廣泛,能夠感染包括人在內(nèi)的幾乎所有的溫血?jiǎng)游?在宿主中能夠入侵所有有核細(xì)胞并且在其中生長(zhǎng)復(fù)制[3]。弓形蟲以孢子化卵囊、包囊和速殖子3種形式感染宿主[4]。其中感染宿主細(xì)胞需經(jīng)過入侵、復(fù)制和逸出3個(gè)過程,當(dāng)宿主免疫力低下時(shí),能夠引起發(fā)燒、肺炎和心肌炎等癥狀[1,5]。

冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain,CSD)是一種高度保守的核酸結(jié)合域,而且在細(xì)菌、植物和動(dòng)物中普遍存在[6]。冷休克蛋白(cold shock proteins,CSPs)在結(jié)構(gòu)上含有1個(gè)或多個(gè)CSD,且在細(xì)菌和植物中的生物學(xué)功能是保守的,均參與冷應(yīng)激的調(diào)節(jié)[7-8]。細(xì)菌的CSPs由單個(gè)CSD 構(gòu)成并具有RNA分子伴侶的活性,在細(xì)菌受到冷應(yīng)激時(shí),能夠穩(wěn)定RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)[9]。在植物擬南芥中,冷休克蛋白AtCSP2參與調(diào)節(jié)冷應(yīng)激反應(yīng),而且AtCSP2 和AtCSP4在擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要作用[8,10]。在脊椎動(dòng)物中,YB-1蛋白是典型的且研究最多的冷休克蛋白,參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,在應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞增殖和DNA 修復(fù)中均具有重要的作用[11]。

盡管CSPs在細(xì)菌、植物以及動(dòng)物中都具有重要的生物學(xué)功能,但是在弓形蟲上還沒有相關(guān)研究。基于此,本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)獲得弓形蟲Tgcsp2基因敲除株,并通過體內(nèi)外試驗(yàn)探究Tgcsp2在弓形蟲中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料SPF 級(jí)別雌性BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;人包皮成纖維(human foreskin fibroblast,HFF)細(xì)胞和弓形蟲RH 株(本實(shí)驗(yàn)室保存);pSAG1::Cas9-U6::Sg UPRT 和p UPRT::DHFRD 質(zhì)粒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)申邦教授饋贈(zèng)。

結(jié)晶紫染色液、5%BSA 封閉液、4%多聚甲醛溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;鼠抗弓形蟲SAG1單抗、Alexa Fluor?488標(biāo)記的兔抗鼠IgG 抗體、Alexa Fluor?594 標(biāo)記的兔抗鼠IgG 抗體購(gòu)自Abcam 公司;Primer Star GXL DNA 聚合酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;細(xì)胞/組織/血液基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京天跟生化科技有限公司。

1.2 細(xì)胞和蟲株培養(yǎng)人成纖維包皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM 培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2。弓形蟲RH 株速殖子通過傳代方式培養(yǎng)于HFF 細(xì)胞中,當(dāng)80%以上HFF細(xì)胞發(fā)生裂解時(shí),收集細(xì)胞及胞外蟲體并破碎細(xì)胞,將其通過孔徑為3～5μm 的濾膜進(jìn)行過濾,將純化后的細(xì)胞繼續(xù)接種于HFF細(xì)胞中傳代培養(yǎng)。

1.3 Tgcsp 2 基因敲除株的構(gòu)建參考CRISPR/Cas9弓形蟲基因編輯方法[12],根據(jù)Tgcsp2的基因序列(TGME49_267470),在E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)網(wǎng) 站上獲取Tgcsp2基因的sg RNA 序列。以pSAG1::Cas9-U6::sg UPRT 質(zhì)粒為模板,Tgcsp2-g RNAFw(5′-GTGAATGTCACCGGTCCAAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′)和Tgcsp2-gRNA-Rv(5′-AACTTGACATCCCCATTTAC-3′)為 上、下游引物,根據(jù)Q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖械恼f明構(gòu)建靶向Tgcsp2基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒(pSAG1::Cas9-U6::sg TgCSP2)。以p UPRT::DHFR-D 質(zhì)粒為模板,DHFR-F(5′-CAGGCTGTAAATCCC-GTGAG-3′)和DHFR-R(5′-GATTCCGTCAGCGGTCTGTCA-3′)分別為上、下游引物,PCR 擴(kuò)增DHFR?抗乙胺嘧啶藥物標(biāo)記,將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,切膠回收。將pSAG1::Cas9-U6::sgTgcsp2質(zhì)粒和DHFR?抗性標(biāo)記通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)入弓形蟲RH 速殖子。經(jīng)乙胺嘧啶篩選獲得ΔTgcsp2陽(yáng)性單克隆蟲株后,用引物Tgcsp2-KO-Fw(5′-GTCACACGTCATGCCAGCAG-3′)和T-gcsp2-KO-Rv(5′-GAAGCGTCCTTCTTGTCG-TC-3′)進(jìn)行PCR 鑒定。

1.4 空斑和裂解試驗(yàn)將純化后的弓形蟲速殖子用含有2%FBS的DMED 培養(yǎng)液稀釋至1×103/m L,然后取200μL(～200個(gè)/孔)加入長(zhǎng)滿HFF細(xì)胞的6孔板中,在37℃,5% CO2條件下靜置培養(yǎng)8 d。去掉上清并用PBS 洗滌后,75%乙醇室溫固定20 min,0.2%結(jié)晶紫溶液染色30 min,然后將染液棄掉,PBS將染液洗去,待其自然晾干后,于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并掃描空斑結(jié)果。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

將純化的速殖子按每孔1×106,5×105,1×105,5×104,1×104的劑量接種于長(zhǎng)滿HFF 的96孔板中,未接種速殖子的孔作為空白對(duì)照。將其置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中72 h后,按照空斑試驗(yàn)的方法進(jìn)行結(jié)晶紫染色,PBS洗滌后,待其自然晾干。將96孔板放于酶標(biāo)儀中,讀取波長(zhǎng)為630 nm 時(shí)的吸光度值,根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞裂解率[13]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5 入侵試驗(yàn)將自然逸出的弓形蟲速殖子純化后按1x105/孔的劑量接種于長(zhǎng)滿HFF 細(xì)胞的6孔板中,將其在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置4 h。PBS 輕輕洗去游離于上清的蟲體后,4%甲醛溶液固定20 min,5%BSA 封閉1 h,加入鼠抗弓形蟲SAG1單克隆抗體并37℃孵育2 h,然后加入Alexa Fluor?594標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體,37℃孵育2 h用于細(xì)胞外速殖子的染色。0.2% Triton X-100將細(xì)胞膜進(jìn)行穿透30 min后,按照上述同樣的方法,將細(xì)胞內(nèi)的速殖子用Alexa Fluor?488標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體進(jìn)行孵育染色。50%甘油進(jìn)行封片后,將6孔板置于熒光顯微鏡中觀察并統(tǒng)計(jì)[14]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)約100個(gè)蟲體。

1.6 胞內(nèi)復(fù)制試驗(yàn)純化的弓形蟲速殖子感染HFF細(xì)胞24 h后,PBS洗去細(xì)胞外的蟲體,4%甲醛 溶 液 固 定20 min,0.2% Triton X-100 穿 透30 min,5%BSA 封閉1 h。加入鼠抗弓形蟲SAG1單克隆抗體于37℃孵育2 h,然后加入Alexa Fluor?594標(biāo)記的兔抗鼠抗體于37℃孵育2 h。50%甘油封片,將其置于熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)100個(gè)納蟲泡。

1.7 逸出試驗(yàn)將純化的弓形蟲速殖子按每孔1×106的劑量接種于長(zhǎng)滿HFF 細(xì)胞的6孔板中,置于37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。PBS清洗3次以除去細(xì)胞外的速殖子,加入10 mmol/L的二硫蘇糖醇誘導(dǎo)速殖子逸出細(xì)胞[15],并設(shè)置空白對(duì)照。誘導(dǎo)5 min后,按照入侵試驗(yàn)中的紅—綠雙染方法區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外的速殖子。并于熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.8 毒力試驗(yàn)將5～6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分組,每組6只,并且適應(yīng)環(huán)境1周。腹腔注射弓形蟲速殖子(100 個(gè)/只)。每天觀察小鼠的活力,并記錄小鼠死亡時(shí)間及個(gè)數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 5.0軟件中的T檢驗(yàn)方法對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)結(jié)果由±s x表 示。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異情況表示為:?P＜0.05;??P＜0.01;???P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 ΔTgcsp2 蟲 株 的 獲 得 將pSAG1::Cas9-U6::sgTgcsp2 質(zhì)粒和DHFR?抗性標(biāo)記轉(zhuǎn)入弓形蟲RH 速殖子之后,CRISPR/Cas9系統(tǒng)使靶基因在sg RNA 序列處發(fā)生雙鏈斷裂(double-strand DNA breaks,DSB),并通過非同源末端連接的方式將大小為3 216 bp的DHFR 片段插入斷裂區(qū)域,使得靶基因的結(jié)構(gòu)被破壞。藥物篩選獲得有抗性的單克隆蟲株,在sgRNA 上、下游設(shè)計(jì)引物并通過診斷PCR鑒定DHFR?是否插入到正確的位置。鑒定結(jié)果顯示在sgRNA 處有DHFR 片段插入(圖1)。

圖1 ΔTgcsp 2蟲株的構(gòu)建與鑒定 A.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和非同源末端連接方法構(gòu)建ΔTgcsp 2蟲株的原理圖;B.PCR 鑒定陽(yáng)性ΔTgcsp 2單克隆蟲株;1.DL5000 DNA Marker;2.RH:ΔTgcsp 2;3.RH

2.2 ΔTgcsp 2蟲株的體外生長(zhǎng)能力檢驗(yàn)通過空斑試驗(yàn)和細(xì)胞裂解試驗(yàn)檢測(cè)ΔTgcsp2蟲株的體外生長(zhǎng)能力(圖2)。ΔTgcsp2蟲株和RH 野生株均能形成空斑,但是ΔTgcsp2蟲株形成的空斑較RH 野生株更小且數(shù)量較少。細(xì)胞裂解結(jié)果顯示,當(dāng)感染劑量為1×105或5×104時(shí),ΔTgcsp2蟲株裂解細(xì)胞的能力低于RH 野生株,當(dāng)感染劑量為5×105時(shí),2個(gè)蟲株間的細(xì)胞裂解能力差異極顯著,感染劑量為1×106時(shí),ΔTgcsp2和RH 株幾乎將所有細(xì)胞全部裂解。

圖2 空斑試驗(yàn)和細(xì)胞裂解試驗(yàn)探究ΔTgcsp 2蟲株的體外感染能力 A.ΔTgcsp 2蟲株與RH 野生株形成的空斑個(gè)數(shù)和大小的對(duì)比結(jié)果;B.不同感染劑量下ΔTgcsp 2蟲株與RH 野生株對(duì)HFF細(xì)胞的裂解程度

2.3 ΔTgcsp 2蟲株的入侵率檢測(cè)通過紅-綠雙染方法可以將細(xì)胞內(nèi)外的速殖子區(qū)分,其中Alexa Fluor?594標(biāo)記的二抗使細(xì)胞外的速殖子在熒光顯微鏡下呈紅色,Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗使細(xì)胞內(nèi)外所有的速殖子在熒光顯微鏡下呈綠色,而疊加之后為橙色的速殖子即為細(xì)胞內(nèi)蟲體。細(xì)胞內(nèi)的速殖子與所有速殖子個(gè)數(shù)的比值即為蟲體的入侵率,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,ΔTgcsp2 蟲株的入侵率明顯小于RH 野生株(圖3)。

圖3 紅-綠雙染試驗(yàn)檢測(cè)ΔTgcsp 2 蟲株的入侵率 A.熒光顯微鏡下觀察ΔTgcsp 2 蟲株與RH 野生株的入侵情況;B.ΔTgcsp 2蟲株與RH 野生株的入侵率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 ΔTgcsp 2蟲株的胞內(nèi)復(fù)制能力檢驗(yàn)為探究ΔTgcsp2蟲株在細(xì)胞內(nèi)的增殖能力,用Alexa Fluor?594標(biāo)記的二抗孵育細(xì)胞內(nèi)的蟲體,使其在熒光顯微鏡下呈紅色。計(jì)數(shù)100個(gè)納蟲空泡,并統(tǒng)計(jì)含有1,2,4,8 個(gè)速殖子的納蟲泡個(gè)數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,ΔTgcsp2蟲株中含2個(gè)速殖子的納蟲泡明顯多于RH 野生株,而含有8個(gè)速殖子的納蟲泡個(gè)數(shù)明顯少于RH 野生株,含有1和4個(gè)速殖子的納蟲泡個(gè)數(shù)在ΔTgcsp2蟲株和RH 株中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

2.5 ΔTgcsp 2蟲株的逸出能力檢驗(yàn)通過紅-綠雙染方法將細(xì)胞內(nèi)外的速殖子區(qū)分,從而可以在熒光顯微鏡下觀察到蟲體的逸出情況,染色情況同入侵試驗(yàn)。結(jié)果顯示,二硫蘇糖醇誘導(dǎo)5 min后,RH 野生株的速殖子全部逸出,而ΔTgcsp2蟲株只有部分逸出(圖5)。

圖4 ΔTgcsp 2蟲株在HFF細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力 A.熒光顯微鏡下觀察ΔTgcsp 2蟲株和RH 野生株納蟲泡內(nèi)速殖子分布情況;B.納蟲泡內(nèi)速殖子個(gè)數(shù)為1,2,4,8的熒光圖;C.ΔTgcsp 2蟲株和RH 野生株內(nèi)含速殖子為1,2,4,8的納蟲空泡個(gè)數(shù)與總納蟲泡個(gè)數(shù)的比值

圖5 二硫蘇糖醇誘導(dǎo)ΔTgcsp 2蟲株和RH 野生株速殖子的逸出情況 A.誘導(dǎo)之前蟲體的分布情況;B.誘導(dǎo)5 min后蟲體分布情況

2.6 ΔTgcsp 2蟲株對(duì)小鼠的毒力檢驗(yàn)將純化的ΔTgcsp2蟲株和RH 野生株等劑量感染6～7周齡BALB/c小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RH 蟲株感染的小鼠在第9天開始死亡,10 d內(nèi)全部死亡。ΔTgcsp2蟲株感染的小鼠在感染后23 d內(nèi)全部死亡(圖6)。

圖6 等劑量的ΔTgcsp 2 蟲株和RH 野生株速殖子感染BALB/c小鼠存活率

3 討論

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索弓形蟲TgCSP2蛋白結(jié)構(gòu),CD Search 結(jié)果顯示,TgCSP2 蛋白含有1 個(gè)CSD 保守域,該結(jié)構(gòu)位于第74～127個(gè)氨基酸之間且具有DNA 結(jié)合的特性,本研究中sgRNA 序列位于該保守域。此外,檢索結(jié)果還表明,TgCSP2的結(jié)構(gòu)與蠟樣芽胞桿菌的Csp C 蛋白以及真核生物的YB蛋白相似,兩者均在生物體轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[11,16]。YB-1是研究最多的YB蛋白,與細(xì)胞遷移、增殖和炎性反應(yīng)有關(guān),此外,將小鼠的YB-1基因敲除后會(huì)引起胚胎致死[17-18]。

本研究中Tgcsp2 基因片段大小為1 051 bp,將片段大小為3 216 bp的DHFR?插入到該基因的CSD 區(qū)域可以破壞該基因的結(jié)構(gòu)及CSD 保守域的功能。如圖1 所示,將含有靶基因sgRNA 序列的CRISPR/Cas9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入蟲體后,Cas9 蛋白會(huì)在sg RNA 的引導(dǎo)下將Tgcsp2基因中與sg RNA 結(jié)合的序列斷裂,DNA 發(fā)生雙鏈斷開后,機(jī)體啟動(dòng)DNA修復(fù)功能。DNA 修復(fù)DSB的機(jī)制包括同源重組和非同源末端連接,而在弓形蟲野生株中更容易發(fā)生非同源末端連接的修復(fù)機(jī)制,因此,本研究將DHFR 片段利用非同源末端連接的修復(fù)機(jī)制插入到Tgcsp2基因中[12]。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,ΔTgcsp2蟲株的入侵能力減弱,在HFF細(xì)胞內(nèi)的增殖能力相對(duì)于RH 株較慢,這些結(jié)果與空斑試驗(yàn)的結(jié)果一致,空斑大小表示蟲體的復(fù)制能力,空斑的數(shù)量表示蟲體的入侵能力。逸出試驗(yàn)結(jié)果表明,ΔTgcsp2蟲株逸出細(xì)胞的能力相對(duì)于RH 株較慢。蟲體對(duì)宿主細(xì)胞的裂解程度與蟲體入侵、復(fù)制和逸出能力有關(guān)。本研究表明,ΔTgcsp2蟲株體外入侵、胞內(nèi)復(fù)制以及逸出能力的下降共同導(dǎo)致其細(xì)胞裂解能力的降低。小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果表明,感染ΔTgcsp2蟲株的小鼠比感染RH 蟲株的小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng),說明ΔTgcsp2蟲株在小鼠體內(nèi)的擴(kuò)散能力減弱,這一結(jié)果與ΔTgcsp2蟲株體外表型研究結(jié)果相一致。

弓形蟲熱休克蛋白Tg HSP90是1個(gè)高度保守的分子伴侶,將弓形蟲Tghsp90基因敲除后,蟲體的入侵能力以及對(duì)小鼠的毒力下降,復(fù)制能力完全喪失[19-20]。本研究將Tgcsp2 基因敲除后,蟲體的表型與ΔTghsp90的表型相似,但是ΔTgcsp2蟲株的復(fù)制能力仍然保留。TgCSP2蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上均與YB-1 蛋白相似,與Tg HSP90 在功能上相似。因此,推測(cè)TgCSP2具有分子伴侶活性,但是具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究證明。

總之,本研究證明了Tgcsp2基因?qū)蜗x體外感染宿主細(xì)胞的影響,而且證明該基因能夠減弱弓形蟲在小鼠體內(nèi)的毒力。這些數(shù)據(jù)將為闡明csps在蟲體發(fā)育中的作用特性以及探究TgCSP2蛋白的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。