司 南,祝令偉,景 潔,梁 冰,王 瑩,紀 雪,鄭 林,陳 萍,郭學軍? (.吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院,吉林 長春308;.軍事醫(yī)學科學院 軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,吉林 長春30)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),又稱產(chǎn)氣芽孢桿菌、厭氧芽孢桿菌或魏氏梭菌,是一種革蘭陽性產(chǎn)芽孢桿菌[1]。在自然界中以芽孢形式存在,機體內可形成莢膜。產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于土壤、食物、污水、糞便及許多健康人和動物的腸道中[2]。在特定條件下該菌的大量繁殖可引起人類和各種動物發(fā)病,引起創(chuàng)傷性感染、惡性水腫、氣性壞疽、壞死性腸炎、厭氧性蜂窩織炎、腸毒血癥、產(chǎn)后分娩敗血癥等感染性疾病。已知產(chǎn)氣莢膜梭菌可分泌超過20種外毒素[3],基于其產(chǎn)生的主要致死性毒素α、β、ε和ι毒素的差異,將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D 和E型共5種毒素型,所有毒素型均能造成人類或動物感染,引起組織損傷[4],其中A 型最容易引起人食物中毒,產(chǎn)氣莢膜梭菌性食物中毒是主要的食源性疾病之一[5]。細菌生物被膜(BBF)[6]是指由附著于惰性或者活性實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的由細菌自身所分泌的含水聚合性基質所組成的結構性細菌群落。生物被膜不僅是細菌存在于自然界的一種重要的生存形式,而且生物被膜的形成是細菌對抗生素廣泛耐藥的重要機制之一[7]。在食品加工的過程中,通常用不銹鋼、鋁面板等設備,其表面具有微細的溝槽和縫隙,更容易滋生細菌,從而形成生物被膜[8]。抗生素耐藥細菌的感染會導致動物及人類的呼吸道和腸道疾病,嚴重者致死,美國每年因此造成的死亡人數(shù)高達23 000人,至少500億美元用于醫(yī)療花費和消耗損失[9]。2016年,刊登于英國著名醫(yī)學期刊《柳葉刀傳染病》上的1篇關于細菌耐藥機制在動物和人類中出現(xiàn)的報道指出,一些細菌對藥物的耐藥不斷打破抗生素防線[10]。

本研究從多地區(qū)采集的遷徙候鳥樣品中分離鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌,并進行分型、檢測其攜帶毒力基因的情況和生物膜形成能力,探討遷徙鳥類攜帶該病原菌通過環(huán)境和食物鏈傳播疾病的風險;并對分離菌株的耐藥性進行分析,了解耐藥菌在其中的流行情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料PCR Master Mix 緩沖液、DNA Marker等PCR 相關試劑為Ta KaRa 公司產(chǎn)品;PCR 引物合成和測序均由吉林省庫美生物有限公司完成;抗生素藥敏檢測E-test Strip(包括四環(huán)素、復方新諾明、氨芐西林、環(huán)丙沙星、莫西沙星、桿菌肽、黏菌素、克林霉素、紅霉素和氯霉素共10種藥敏檢測試紙條)為法國梅里埃(Biomerieux)公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基藥敏試驗使用MH 培養(yǎng)基,購自法國梅里埃公司,細菌培養(yǎng)基及其添加成分和厭氧產(chǎn)氣袋等購自青島海博生物公司。細菌分離培養(yǎng)使用胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板,增菌培養(yǎng)使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)并添加5%無菌脫纖維綿羊血,按照產(chǎn)品說明書配制。

1.3 菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株ATCC 13124由本室保存,為毒素A 型。

1.4 糞便樣品采集和處理家禽類糞便樣品的采集:糞便發(fā)酵池或自然堆肥,隨機選5點,剝離表層20 cm 糞便棄去,采集深層糞便樣本100 g/份(帶乳膠手套,外層帶一次性塑料手套,用手抓取,然后將一次性手套翻轉,連手套放入自封袋),運輸途中加冰袋保證低溫,實驗室內－20℃凍存。

候鳥類糞便樣品的采集:根據(jù)候鳥遷徙規(guī)律,在重要棲息地候鳥大規(guī)模聚集、停留的時間段采集樣品,首先使用望遠鏡遠距離觀察鳥群,記錄候鳥種類,使用無菌棉拭子蘸取新鮮糞便放入含有1 m L生理鹽水保存液的離心管中,樣品放置在采樣箱中冷鏈運送。在實驗室內將采樣管混合震蕩至均勻后,自然沉降2 min,取上層懸液分離細菌。

1.5 病料樣品采集和處理采集死亡時間1 d以內、個體保存完整,觀察體表無明顯潰爛和傷口的死亡鳥類,放置在采樣箱中冷鏈運送。在生物安全柜中采取組織樣品,將動物仰臥,腹部去毛,用酒精棉擦拭腹部,從兩側剪開,取出完整的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟,分別放置于平皿中,取病變部位腸段置于平皿中。

1.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)及鑒定參照國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗—產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗GB/T 4789.13》進行細菌的分離培養(yǎng),并結合PCR方法鑒定。糞便樣品:吸取懸液50μL,接種于5 m L的FTG 增菌液中,37℃培養(yǎng)8～12 h后在TSC 瓊脂平板劃線,37℃厭氧罐培養(yǎng)16～18 h;臟器樣品:用酒精棉球對臟器表面進行消毒,剪開待檢臟器,接種環(huán)從切面蘸取滲出物,在TSC瓊脂平板劃線。

挑取TSC 瓊脂平板上生長的黑色菌落接種FTG 增菌液,37℃培養(yǎng)8～12 h。觀察產(chǎn)氣情況,革蘭染色鏡檢,然后進行PCR 鑒定。PCR 陽性的增菌液,使用TSC瓊脂平板進行2次純化,再次挑取黑色菌落接種增菌并進行PCR鑒定,然后保存菌種。

1.7 引物合成參考相關文獻[11-12]合成用于產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定和毒素分型的引物(表1)。

1.8 多重PCR 鑒定菌株的毒素型參照YOO等[11]的方法進行多重PCR 鑒定菌株的毒素型,其中僅有α毒素為A 型,含α、β、ε毒素為B型,α、β毒素為C型,α、ε毒素為D 型,α、ι毒素為E 型。PCR反應體系為25.00μL 包括:2×PCR Master Mix 12.50μL,引 物(10 nmol/L)每 條0.25μL,模 板DNA 2.00μL,蒸餾水補足25.00μL。擴增條件:95℃預變性1 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)35次;72℃再延伸5 min,冷卻至4℃。PCR 完成后,1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結果并拍照。

1.9 生物被膜形成測定挑取在TSC 瓊脂平板上生長狀態(tài)良好的新鮮黑色菌落,接種TGY 肉湯(3.0%胰蛋白胨,2.0%葡萄糖,1.0%酵母膏和0.1%半胱氨酸)中37℃厭氧培養(yǎng)24 h。按照1∶10比例重新接種TGY肉湯,聚苯乙烯培養(yǎng)板上37℃厭氧培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后,去除培養(yǎng)基,用1%PBS洗滌2次,去除浮游細菌。用結晶紫(CV)法測定生物膜的形成,每孔用1%CV 溶液染色,室溫下孵育10 min。經(jīng)1%PBS充分洗滌后,乙醇孵育15 min,用微孔板讀數(shù)儀測定595 nm 處的吸光度[13]。每個菌株設3個重復孔,同時設陽性對照和空白對照,使用空白對照調零,平均D值＞0.2判為陽性。

表1 產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定引物

1.10 耐藥性分析參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(clinical laboratory standards institute,CLSI)推薦的方法[14],測定抗生素的最小抑菌濃度(MIC值),使用金葡菌ATCC 29213作為對照菌株。挑取MHⅡ瓊脂平板上純化的細菌培養(yǎng)物,MH 液體培養(yǎng)基稀釋至0.5麥氏比濁度,然后用滅菌棉簽蘸取菌液,均勻涂抹于MHⅡ瓊脂平板,貼上Biomerieux公司的E-test藥敏檢測試紙條,37℃厭氧培養(yǎng)14～16 h觀察結果,根據(jù)讀數(shù)判斷耐藥(R)中介(I)和敏感(S)。

2 結果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定經(jīng)過TSC 平板分離培養(yǎng)后,挑取黑色的單菌落,PCR 鑒定α毒素陽性的菌株判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。糞便樣品采集信息以及細菌分離鑒定的結果如表2所示。從549份遷徙候鳥的糞便中共分離出42株產(chǎn)氣莢膜梭菌,總分離率7.7%;同時,從長春某大型蛋雞場采集糞便41份,分離菌株14株,分離率為34.2%。

表2 糞便樣品采集信息以及細菌分離鑒定結果

從3次野生候鳥死亡的疫情[15]中共采集35只保存完整的個體,其中從吉林松花江1只、內蒙古烏梁素海和達里湖各2只死亡鳥類的組織病料樣品中共分離出11株產(chǎn)氣莢膜梭菌(表3)。

2.2 細菌毒素分型和主要毒力基因鑒定參照YOO 等[11]的多重PCR 方法鑒定分離菌株的毒素型,根據(jù)PCR 鑒定的結果:從廣西南寧夜鷺分離1株E 型菌,從廣西北海鸻鷸類分離2株E 型,從吉林松花江死亡鳥類病料組織分離2株E 型菌(肺臟和病變腸道分離各1株),候鳥糞便和組織病料樣品中分離菌株均為A 型菌;所有養(yǎng)雞場分離菌株均為A 型。A 型菌株僅α毒素基因為陽性,E 型菌株α和ι毒素基因為陽性(圖1)。鑒于E 型菌沒有陽性對照菌株,將ι毒素基因的PCR 擴增產(chǎn)物進行測序分析,通過BLAST 比對證明5株E 型菌的測序結果全部與已知E 型菌株[16]pCPPB-1質粒上(NCBI登陸號AB604032.1)ι毒素基因的同源性在99%以上,證明本研究分離菌株中確實攜帶ι毒素基因。通過PCR 鑒定另外的3種重要毒素基因(腸毒素、β2毒素和NetB毒素),所有分離菌株均為陰性。

表3 死亡鳥類病料樣品中細菌分離鑒定結果

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株毒素分型的多重PCR 鑒定 1～4.E 型 分 離 株;5～8.A 型 分 離 株;9.A 型 標 準 菌 株ATCC13124;10.陰性對照;M.DL1500 DNA Marker

2.3 生物被膜的形成通過結晶紫染色定量法,測定分離到的53株候鳥源菌株生物被膜形成能力,經(jīng)測定,有30株菌株能夠在聚苯乙烯培養(yǎng)板上形成生物被膜,經(jīng)CV 染色后,形成生物被膜的細菌培養(yǎng)孔吸光度值遠高于對照孔。使用空白對照調零后,陽性對照平均值為0.873,檢測生物被膜陽性的各菌株平均D值(圖2)。

圖2 生物被膜形成測定結果 1～30.產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株;31.標準菌株ATCC13124;N.空白對照組

表4 候鳥分離產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性分析

2.4 耐藥性分析測定53株候鳥源菌株對10種抗生素的MIC值,根據(jù)CLSI對厭氧梭菌類細菌的耐藥性判定標準,統(tǒng)計敏感和耐藥率的結果如表4所示。CLSI沒有給出梭菌類對黏菌素的耐藥性判定標準,但是本次檢測所有菌株的MIC值都超過試紙條的檢測范圍(≥256 mg/L),因此判定所有菌株均為耐藥。其中,共有5株菌株對超過5種以上的抗生素具有耐藥性,可被認為是超強耐藥菌(表4)。

3 討論

目前,我國因感染產(chǎn)氣莢膜梭菌引起人類食物中毒的病例報道比較少,缺乏詳細的流行病學統(tǒng)計資料,但由于衛(wèi)生條件和飲食習慣等因素,產(chǎn)氣莢膜梭菌仍是一種不可忽視的致病菌,也引起世界范圍內的廣泛關注,其對食品安全和公共衛(wèi)生都是嚴峻的威脅,國內外對該病原菌在人的感染以及各種家養(yǎng)畜、禽中感染流行的情況都有很深入的研究[4-5,12-14],但是極少有人關注其在野生動物中的感染流行情況。

本研究從全國多地區(qū)采集野生鳥類的糞便和病料樣品,對菌株進行分離鑒定。同時,為驗證分離鑒定方法的準確性,從長春某大型蛋雞場采集糞便進行細菌的同步分離鑒定。因為產(chǎn)氣莢膜梭菌本身是許多健康人和動物腸道中的常在菌[12-13],畜禽養(yǎng)殖場因為其集約化水平高、通風性差,又為病原菌的隱藏、孽生提供了場所;而本次采樣時間在冬季,養(yǎng)殖場為了保溫而忽視通風,更是為細菌的傳播提供便利,本次在雞場的分離率較高為34.2%。相比之下,野生鳥類的分離率就比較低,從549份糞便樣品中分離出42株產(chǎn)氣莢膜梭菌,總分離率為7.7%。采集的糞便樣品涉及多種類型的候鳥,包括雁鴨類、鷺類、鸕鶿和鸻鷸類等,不同的鳥類細菌分離率也有所不同,其中雁鴨類總分離率3.0%,而鷺類和鸕鶿總分離率為12.9%。這可能和不同鳥類的覓食習性和棲息環(huán)境等相關,雁鴨類以植食性為主,主要棲息在大的河流和湖泊等遠離人類生活區(qū)的地方;而鷺類主要覓食魚蝦和甲殼類等動物性食物,往往在農田、魚塘甚至人類的生活區(qū)覓食,因此產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離率要高于雁鴨類。而從廣東肇慶星湖保護區(qū)人工飼養(yǎng)的丹頂鶴糞便樣品中細菌分離率最高(34.6%),也說明鳥類攜帶產(chǎn)氣莢膜梭菌的情況與人類接觸密切相關。

因為候鳥屬于長距離遷徙的野生動物,在遷徙過程中通過各種途徑接觸病原菌,有可能通過多種途徑傳播給人類和家養(yǎng)畜禽,比如與禽類的直接接觸、空氣傳播、排泄物對水源和水產(chǎn)品的污染等,由此引發(fā)的食品衛(wèi)生和公共安全問題都值得關注。本研究還從吉林松花江等野生鳥類大批死亡疫情中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離到該菌株的死亡鳥類表現(xiàn)不同程度的腸道水腫、出血和多臟器組織壞死、出血等癥狀,與動物產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸毒血癥類似[3,12],說明產(chǎn)氣莢膜梭菌也能夠引起野生鳥類的感染和死亡。

對所有分離株進行毒素基因分型,A 型分離率高達90.0%以上,A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌可導致人和動物氣性壞疽以及牛、馬、禽類等壞死性腸炎,被該菌污染的禽肉和蛋存在食品安全隱患[13]。另外還有5株E型菌,E型菌株可引起羔羊、犢牛和家兔患腸毒血癥并急性死亡[17],E 型產(chǎn)氣莢膜梭菌首次被發(fā)現(xiàn)在2013年,KIM 等[18]從腹瀉而死的僅僅2日齡的小羊小腸內分離得到。在我國,由于各個地區(qū)存在著區(qū)域性和季節(jié)性的差異,據(jù)張成林等[19]統(tǒng)計,春季時發(fā)病率最高的地區(qū)基本為西部地區(qū)、黃河以北和黃河長江間,夏季發(fā)病率最高的地區(qū)為長江以南,統(tǒng)計結果顯示,從北向南,發(fā)病率呈下降趨勢。由遷徙候鳥攜帶并引起鳥類感染死亡的報道在國內外都屬于首例。本試驗中未鑒定出B、C和D 型菌株。

除了毒素基因分型的α、β、ε和ι毒素之外,產(chǎn)氣莢膜梭菌還有另外一些重要的毒素,如β2 毒素(cpb2基因編碼),其與β毒素具有相似的生物學活性,也是具有細胞毒性和致死性的一種強毒素[20-22];NetB毒素,是2008年在A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的壞死性腸炎病雞體內首次分離到的1種新毒素,它能使宿主細胞形成1.6～1.8 nm 親水性的孔洞,最終導致細胞破裂[23];腸毒素(cpe基因編碼),是引起氣莢膜梭菌性食物中毒腹瀉和嘔吐癥狀的一個非常重要的原因,嚴重時,毒素(或細菌與毒素)可進入血液循環(huán),引起毒血癥(或敗血癥),從而導致機體全身衰竭、死亡[24]。這些毒素在病原菌感染過程中都能夠發(fā)揮重要作用,但是本研究分離菌株均未檢測到這些毒素。

本研究還對分離菌株耐藥性的情況進行分析,結果顯示,候鳥攜帶菌株的耐藥性也非常嚴重。其中,對黏菌素的耐藥率達到100%,因為未見相關報道,推測產(chǎn)氣莢膜梭菌對黏菌素為天然耐藥。其次為紅霉素、克林霉素和桿菌肽,耐藥菌的比例都在40%以上;而對氯霉素、復方新諾明、氨芐西林、環(huán)丙沙星、莫西沙星耐藥的情況較輕,敏感菌所占的比例在70%以上。有5株菌對超過5種以上的抗生素具有耐藥性,可認為是超強耐藥菌。

耐藥菌的傳播將會給人產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的治療帶來很大壓力,造成抗菌藥物治療效果下降,疾病遷延不愈等后果,嚴重威脅人類健康,產(chǎn)生公共安全的隱患。因此,了解產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染源,分析傳播途徑和耐藥性,對預防和臨床治療具有重要意義。同時應避免濫用抗生素,否則會導致病原菌獲得不同程度的抗藥性,給細菌性疾病防治帶來困難,也會對食品安全和人類健康帶來風險。