胡慧慧,孫亞偉,李文婭,鄺啟紅,孫華潤,吳 華,胡功政,苑 麗? (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州450046;.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)45300)

在腸桿菌科細(xì)菌中,質(zhì)粒接合作用是水平基因傳播(horizontal gene transfer,HGT)最主要的方式之一。參與質(zhì)粒接合作用的調(diào)控蛋白有很多,其中H-NS核蛋白[1]Cpx AR/Arc AB 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system,TCS)[2]發(fā)揮了很重要的作用。H-NS 核蛋白是腸桿菌科細(xì)菌中一種核酸樣DNA 結(jié)合蛋白,能識別和選擇性沉默外源性基因,從而可有效避免細(xì)菌因獲得和表達(dá)過多外源性基因而耗費(fèi)大量的能量[3-5]。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是革蘭陰性菌體內(nèi)常見的調(diào)控元件之一,能調(diào)控多種基因的表達(dá),是目前極具吸引力的對原核生物有高度選擇性的抗菌作用新靶標(biāo)[6],其中Cpx AR 是腸桿菌科細(xì)菌中常見的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[2]。

采用 Red 同源重組[7-11],對大腸桿菌ATCC25922中cpx R和hns基因進(jìn)行敲除,構(gòu)建單/雙基因缺失株及它們的回補(bǔ)菌株,為研究H-NS及Cpx AR 互作調(diào)控IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒菌株:大腸埃希菌ATCC?25922,購自中國普通微生物菌種保存中心,由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒:p KD4,兩側(cè)含有FRT 位點(diǎn)的卡那霉素抗性(kanr)基因,是基因敲除的輔助性質(zhì)粒。p KD46,同源重組的協(xié)助質(zhì)粒,含有溫度敏感型復(fù)制子和氨芐西林(Amp)抗性,經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后能夠表達(dá)Gam、Beta和Exo等3種同源重組酶。p CP20質(zhì)粒,具有氯霉素和Amp 抗性,用于消除FRT 位點(diǎn)的kanr基因[12];pBAD/His A 質(zhì)粒,具有Amp抗性,主要用于構(gòu)建cpx R和hns的過表達(dá)載體。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑LB肉湯、LB瓊脂均購于北京路橋技術(shù)有限公司;SOC 購于北京索萊寶生物科技有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒和DNA 膠回收試劑盒購于美國OMEGA 公司;高保真DNA 聚合酶,XholⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶,T4DNA 連接酶、PCR Mix、DpnⅠ酶等均購于Ta KaRa 公司。BM2000 DNA Marker為Bio Med公司產(chǎn)品;Trans2K DNA Marker和Trans5K DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。氨芐西林鈉、卡那霉素均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 菌株的復(fù)蘇取甘油保存的菌種,按1∶100比例無菌接種于5 m L 新鮮的LB 肉湯,置于37℃震蕩培養(yǎng)12～16 h,然后用接種環(huán)無菌挑取一環(huán)菌液劃線接種于LB 瓊脂平板上,倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)12～16 h,后釣取單個(gè)菌落接種于LB 肉湯,37℃震蕩培養(yǎng)12 h后備用。

1.4 質(zhì)粒提取p KD4、p KD46、pCP20、pBAD/His A 等質(zhì)粒的提取按照美國OMEGA 公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書進(jìn)行,將收集的液體置于－20℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)

1.5.1 缺失株構(gòu)建所用引物 根據(jù)GenBank公布的cp x R和hns的核苷酸序列,應(yīng)用Primer 5.0分析軟件設(shè)計(jì)6對引物(表1)。其中LCR-F/LCR-R和LHN-F/LHN-R 為敲除引物,用于PCR 擴(kuò)增同源重組的線性打靶片段;CR-F/CR-R 和HN-F/HN-R 為cp x R和hns敲除鑒定引物,用于檢測cpx R/hns缺失突變株;KF/KR 用于檢測插入的kanr基因;引物組合CR-F/KR、KF/CR-R、HN-F/KR、KF/HN-R 用于驗(yàn)證kanr基因的插入位置[13]。

1.5.2 回補(bǔ)菌株構(gòu)建所用引物 參照GenBank上已公布的cpx R和hns的全基因序列,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)4 對引物(表1)。其中cp x R-1-F/cp x R-1-R、hns-1-F/hns-1-R,用于擴(kuò)增包含cpxR 和hns的全基因長片段,cpx R-F/R 或hns-F/R 是帶有雙酶切位點(diǎn)的cpx R、hns完整的開放閱讀框(open reading frame,ORF)。

1.6 cpxR 和hns 缺失株的構(gòu)建

1.6.1 線性打靶片段的制備及鑒定 以p KD4為模板,分別用引物L(fēng)CR-F/LCR-R 和LHN-F/LHN-R擴(kuò)增線性打靶片段(中間含kanr基因,兩側(cè)包含cpx R/hns同 源 臂 的PCR 產(chǎn) 物)。所 得PCR 產(chǎn) 物 用OMEGA 公司的DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行純化,純化后的膠回收產(chǎn)物用DpnⅠ酶消化后,分別加入適量的DpnⅠ酶和10×T Buffer,37℃過夜消化,用膠回收試劑盒純化,測序鑒定。

1.6.2cpx R和hns基因缺失 將p KD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至新制備的大腸桿菌ATCC25922 感受態(tài)細(xì)胞中,在含有適量Amp 的LB 平板上篩選,獲得ATCC25922/p KD46菌株。

ATCC25922/p KD46 菌株經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后作為受體,將1.6.1獲得的線性打靶片段電擊轉(zhuǎn)化入受體中,在含有適量Kan的LB 平板上篩選轉(zhuǎn)化子。用CR-F/CR-R 或HN-F/HN-R、CR-F/KR或HN-F/KR、KF/CR-R 或KF/HN-R、KF/KR 4對引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證,PCR 產(chǎn)物送擎科公司測序鑒定。

表1 cpx R 和hns 敲除所用引物

1.6.3 p KD46和kanr基因的消除 挑取鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種LB 平板,43℃培養(yǎng)6 h,將培養(yǎng)物接種于含Amp的LB 平板,37℃培養(yǎng)18 h觀察是否有細(xì)菌生長。隨后,將除去p KD46的陽性轉(zhuǎn)化子接種于含適量卡那霉素的LB上培養(yǎng)。

將p CP20 電轉(zhuǎn)入陽性轉(zhuǎn)化子中,然后接種在LB(含氯霉素和Amp)平板上,30℃過夜培養(yǎng)后,挑取單個(gè)菌落接種于LB 肉湯,43℃培養(yǎng)6 h,將菌液分別接種于含Amp/Kan 的LB 平板,37℃培養(yǎng)18 h,如無細(xì)菌生長,則上述菌液即為目標(biāo)重組菌,分別用檢測引物CR-F/CR-R、HN-F/HN-R 對重組菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證,并測序鑒定,確認(rèn)為缺失株的分別命名為△cp x R和△hns。

1.7 構(gòu)建cpx R 和hns 雙基因缺失株以菌株△cp x R為研究對象,利用Red同源重組技術(shù)將兩側(cè)包含hns同源臂的線性打靶片段替代△cpx R菌中的hns基因,構(gòu)建cp x R和hns的雙基因缺失株(標(biāo)記為△cpx R△hns:kanr),用檢測引物CR-F/CR-R、HN-F/HN-R、HN-F/KR、KF/HN-R、KF/KR 分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證,并測序鑒定。

1.8 回補(bǔ)菌株的構(gòu)建以大腸桿菌ATCC25922的DNA 為模板,用引物cpx R-1-F/cpx R-1-R 和hns-1-F/hns-1-R 分別擴(kuò)增包含cpx R和hns的全基因長片段。再以PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,用cpx R-F/cpx R-R 或hns-F/hns-R 擴(kuò)增出含有酶切位點(diǎn)的cpxR、hns完整ORF。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,與p BAD/His A 質(zhì)粒同時(shí)用XholⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后,用T4DNA Ligase 4℃過夜連接,連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用引物cpx R-F/cpx R-R、hns-F/hns-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證,提取重組質(zhì)粒用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定,并送擎科公司進(jìn)行測序比對,確證后分別標(biāo)記為cp x R-pBAD/His A、hnspBAD/His A 重組質(zhì)粒。

將構(gòu)建成功的cpx R-p BAD/His A、hns-p BAD/His A 重組質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞△cpx R、△hns和△cpx R△hns:kanr中,在 含 適 量Amp的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,即為回補(bǔ)菌株,分 別 命 名 為△cpxR/pcpxR、△hns/phns、△cpxR△hns/pcpxR和△cpxR△hns/phns。

2 結(jié)果

2.1 cpxR 和hns 單基因缺失株的鑒定cpx R和hns單基因缺失株在含有Kan的LB平板上長成邊緣光滑、濕潤、有光澤、白色略透明的單個(gè)小菌落。分別用CR-F/CR-R 或HN-F/HN-R、CR-F/KR 或HN-F/KR、KF/CR-R 或KF/HN-R、KF/KR 4 對引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證時(shí),均出現(xiàn)預(yù)期大小的目的片段(圖1,2),測序結(jié)果顯示,cpx R和hns基因均已被線性打靶片段代替,分別標(biāo)記為△cpx R:kanr和△hns:kanr。

圖1 cpx R 基因Red 同源重組PCR 鑒定電泳圖 M.Trans5000 DNA Marker;1.CR-F/CR-R 引 物 擴(kuò) 增ATCC25922中cpx R 的PCR 產(chǎn) 物;2.CR-F/CR-R 引物擴(kuò)增△cpx R:kan r中打靶片段替代cpx R 后的片段;3.CR-F/KF 引物擴(kuò)增kan r基因插入位點(diǎn)上游片段;4.KR/CR-R 引物擴(kuò)增kan r基因插入位點(diǎn)下游片段;5.用KF/KR 引物擴(kuò)增kan r基因內(nèi)的片段

2.2 消除kan r的鑒定以△cpx R:kanr、△hns:kanr、△cpx R和△hns為模板,CR-F/CR-R 和HNF/HN-R 為引物,PCR 擴(kuò)增cpx R和hns基因,結(jié)果均得到與預(yù)期一致的目的條帶(圖3,4)。測序結(jié)果顯示kanr已被成功消除,僅殘留長為83 bp的FRT位點(diǎn),說明利用此方法已成功將△cp x R:kanr和△hns:kanr中的kanr基因消除,構(gòu)建出△cp x R和△hns的單基因缺失株。

圖2 hns 基因Red 同源重組PCR 鑒定電泳圖 M.Trans5000 DNA Marker;1.HN-F/HN-R 引 物 擴(kuò) 增ATCC25922中hns 的PCR 產(chǎn) 物;2.HN-F/HN-R 引物擴(kuò)增△hns:kan r中打靶片段替代hns 后的片段;3.HN-F/KF 引物擴(kuò)增kan r基因插入位點(diǎn)上游片段;4.KR/HN-R 引物擴(kuò)增kan r基因插入位點(diǎn)下游片段;5.KF/KR 引物擴(kuò)增kan r基因內(nèi)的片段

圖3 消除△cpx R:kan r 株的kan r 基因電泳圖 M.Trans5000 DNA Marker;1～2.以△cp x R:kan r 和△cpx R 為模板用引物CR-F/CR-R 擴(kuò)增cp x R 的電泳條帶

2.3 cpxR 和hns 雙基因缺失株的鑒定以構(gòu)建的雙基因缺失株△cp x R△hns:kanr為模板,用CR-F/CR-R、HN-F/HN-R、HN-F/KR、KF/HN-R 和KF/KR 等5對引物分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增進(jìn)行鑒定,結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段(圖5)。

2.4 回補(bǔ)菌株的構(gòu)建及鑒定將cpx R、hns的完全開放閱讀框分別連接pBAD/His A 載體并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α后,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)PCR 鑒定均分別擴(kuò)增出cpx R和hns的完整ORF,經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切(圖6)證實(shí)為cpx R-p BAD/His A 和hns-p BAD/His A 重組質(zhì)粒。

圖4 消除△hns:kan r株的kan r基因電泳圖 M.Trans5000 DNA Marker;1～2.以△hns:kan r和△hns 為模板用引物HN-F/HN-R 擴(kuò)增hns 的電泳條帶

圖5 △cpx R△hns:kan r雙基因缺失株的鑒定 M.Trans5000 DNA Marker;1.CR-F/CR-R 引 物 擴(kuò) 增△cpx R 中cpx R 基 因;2.HN-F/HN-R 引 物 擴(kuò) 增△cpx R 中hns基因;3.HN-F/HN-R 擴(kuò)增△cpx R△hns:kan r中打靶片段替代hns 后的片段;4.HN-F/KR 擴(kuò)增△cpx R△hns:kan r中kan r基因插入位點(diǎn)上游片段;5.用KF/HN-R 擴(kuò)增△cpx R△hns:kan r中kan r基因插入位點(diǎn)下游片段;6.用KF/KR 擴(kuò)增kan r基因內(nèi)的片段

3 討論

質(zhì)粒接合作用是耐藥基因在菌屬間快速水平散播的最主要方式之一,但多種因素會明顯制約接合型質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率的高低。制約因素可總結(jié)為下列2種:一為外部因素,包括供體菌細(xì)胞濃度、細(xì)胞生長速度、外界能量供給、抗菌藥選擇性壓力等[14];另一個(gè)為內(nèi)部因素,主要包括質(zhì)粒轉(zhuǎn)移基因(transfer,tra)的表達(dá)[15]和菌體內(nèi)各種調(diào)控蛋白[16]的調(diào)控,其中tra基因正常表達(dá)是質(zhì)粒發(fā)生接合轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),而調(diào)控蛋白主要通過直接或間接抑制或激活tra基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用[17],參與質(zhì)粒接合作用的調(diào)控蛋白主要包括H-NS核蛋白和雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Cpx AR/Arc AB等。

圖6 cpx R 和hns 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 M.Trans5000 DNA Marker;1.cp x R-pBAD/His A 重 組 質(zhì) 粒;2.cpx R-pBAD/His A重組質(zhì)粒的XhoⅠ和HindⅢ雙酶切條帶;3.hns-pBAD/His A重組質(zhì)粒;4.hns-pBAD/His A重組質(zhì)粒的XhoⅠ和HindⅢ雙酶切條帶

本課題組在研究產(chǎn)CTX-M 型雞大腸埃希菌的散播機(jī)制中發(fā)現(xiàn),IncFⅡ質(zhì)粒不僅是多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌中最常見的自主復(fù)制接合型質(zhì)粒,而且其在耐藥基因快速水平散播過程中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[18]。目前,人們對少數(shù)質(zhì)粒接合作用的調(diào)控方式有了初步的認(rèn)識和了解,但對于IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的調(diào)控方式尚不清楚,而且也不明白諸多調(diào)控蛋白之間的互作調(diào)控機(jī)制。

本研究利用Red同源重組的方法,將大腸桿菌ATCC25922的cpx R和hns基因敲除,用來研究調(diào)節(jié)蛋白H-NS及雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)Cpx AR 互作調(diào)控IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的分子機(jī)制,但是改變單一基因的表達(dá)量,往往達(dá)不到預(yù)期的理想效果。所以本研究又進(jìn)一步在cpx R的基礎(chǔ)上再次利用此方法缺失hns基因,構(gòu)建雙基因缺失株,以及它們的缺失回補(bǔ)菌株,在對單基因缺失△cpx R的PCR 檢測時(shí),用了CR-F/CR-R、KF/KR、CR-F/KR、KF/CRR 共4對引物。CR-F/CR-R 是1 對包含cpx R較長片段的引物,用其擴(kuò)增缺失前菌株和kanr基因替代cp x R基因后的菌株都獲得了預(yù)期大小的片段,缺失前為1 356 bp,同源重組后為2 407 bp,KF/KR是從kanr基因內(nèi)部選取一段引物,用來檢測同源重組后打靶片段成功替換cpx R基因。CR-F/KR、KF/CR-R 用于檢測kanr基因插入的位置,用以上引物擴(kuò)增都獲得了預(yù)期大小的片段。用p CP20 質(zhì)粒去除kanr片段,篩選出來的重組子用CR-F/CR-R擴(kuò)增,得到與預(yù)期一致的目的條帶,測序結(jié)果顯示,只剩下很短的(83 bp)殘留的FRT 位點(diǎn),證明cpx R被成功敲除。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4對引物能更明顯更直觀的檢測出缺失株構(gòu)建是否成功,以及同源重組的位置是否正確。

本研究利用Red 同源重組技術(shù),成功構(gòu)建cpx R和hns的單/雙基因缺失株及相應(yīng)的回補(bǔ)株,為構(gòu)建IncFⅡ質(zhì)粒的各種重組菌提供了有力的保障,并為進(jìn)一步研究H-NS 及Cpx AR 互作調(diào)控IncFⅡ質(zhì)粒接合作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。