沙萬里,閆 滿,劉東旭,尹柏雙,李國江 (.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,吉林 吉林市320;2.吉林省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 吉林市320)

哺乳動物腸道內(nèi)大約有1014個細(xì)菌[1],在健康動物中處于動態(tài)平衡狀態(tài),同時,固有免疫防御在防止微生物入侵中又起到至關(guān)重要的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)微生物能夠刺激機(jī)體誘導(dǎo)胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,Reg)的產(chǎn)生,該蛋白與細(xì)胞增殖[4]、抑制炎癥[5]和細(xì)胞凋亡有關(guān)[6],其中Reg蛋白中的RegⅢ在防止共生菌和致病菌穿透腸道屏障方面至關(guān)重要[7]?？咕腞egⅢγ作為抑菌蛋白,其抗菌作用具有一定的選擇性,它能夠特異性的與肽聚糖結(jié)合,由于革蘭陽性菌胞外肽聚糖較厚,因此更易與RegⅢγ結(jié)合并促使其對細(xì)胞壁的穿孔作用,同時RegⅢγ也能結(jié)合少部分的革蘭陰性菌如鼠傷寒沙門菌,綠膿桿菌等[8]。

研究發(fā)現(xiàn)在腸上皮細(xì)胞表面和微生物間,分隔出大約50μm 的距離,RegⅢγ是維持這個空間結(jié)構(gòu)的重要因素,通過對入侵微生物的抑制及對組織損傷的修復(fù)以維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9]。RegⅢγ在腸道組織損傷后大量增加[10],但是關(guān)于腸道中RegⅢγ被調(diào)節(jié)表達(dá)的作用機(jī)理并不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠灌服鼠類檸檬酸桿菌后,IL-22 水平顯著增高進(jìn)而誘導(dǎo)腸道RegⅢγ大量表達(dá)以抑制鼠類檸檬酸桿菌感染腸道[11]。此外在腸道中除了IL-22能夠誘導(dǎo)RegⅢγ表達(dá)外,Toll樣受體(TLR)信號通路中的MyD88途徑對RegⅢγ的調(diào)節(jié)也起到重要作用,當(dāng)小鼠缺乏MyD88 基因時,小鼠腸道RegⅢγ表達(dá)量顯著低于正常小鼠腸道中RegⅢγ的表達(dá)量,從而更易導(dǎo)致微生物入侵腸道的幾率大大增加[12]。因此腸道微生物主要通過激活I(lǐng)L-22或TLR-My D88信號通路誘導(dǎo)抗菌蛋白RegⅢγ的產(chǎn)生,從而抑制細(xì)菌的侵入。然而作為益生菌的乳酸菌定植腸道是否同樣誘導(dǎo)RegⅢγ的表達(dá),以及其主要誘導(dǎo)途徑尚不清楚。

本研究前期結(jié)果表明,混合乳酸菌具有刺激腸道上皮細(xì)胞使其分泌抗菌肽RegⅢγ的能力,可誘導(dǎo)小鼠腸道樹突狀細(xì)胞的分化成熟[13],但乳酸菌在腸道RegⅢγ表達(dá)通路中是否通過My D88信號通路尚不明確。本研究將通過灌胃小鼠混合乳酸菌,進(jìn)一步探索RegⅢγ在腸道中的表達(dá)與組織修復(fù)過程中MyD88的特異性誘導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠:4～5周齡雌性SPF Balb/c小鼠(北京華阜康生物科技有限公司),飼養(yǎng)在獨(dú)立通風(fēng)飼養(yǎng)器中,食物和水都經(jīng)過高壓滅菌,成長到8～10周齡后,進(jìn)行免疫試驗(yàn)。細(xì)菌菌株:Lactobacillus acidophilusATCC 4356,Lactobacillus rhamnosus

GG ATCC53103 由美國模式培養(yǎng)物研究所提供,Lactobacillus plantarumA 菌株接種于MRS培養(yǎng)基中37℃厭氧條件下培養(yǎng)。Escherichia coliBL21由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心提供,菌株接種于LB 培養(yǎng)基中,37℃需氧條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌灌胃方案Lactobacillus acidophilus

ATCC 4356、Lactobacillus rhamnosusGG ATCC-53103、Lactobacillus plantarumA 經(jīng)MRS培養(yǎng)基37℃厭氧條件下培養(yǎng),調(diào)制總量為3×109CFU/m L(低計量)和3×1010CFU/m L(高劑量)混合乳酸菌,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后備用。每只小鼠灌胃3×109和3×1010CFU/m L 菌體。連續(xù)灌胃2周,對照組自由飲水。2周后處死小鼠,取小腸與結(jié)腸。

1.2.2 RNA 的提取及Quantitative Real-time PCR

按照TaRa Ka Mini BEST Universal RNA Extraction Kit說明書方法對小鼠十二指腸與結(jié)腸進(jìn)行總RNA 提取,參照TaRa Ka Prime ScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒對完整的RNA 片段500 ng RNA 進(jìn) 行cDNA 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成,使 用SYBR 染 料及Step One Plus實(shí)時熒光定量PCR 系統(tǒng)對cDNA進(jìn)行熒光定量。引物序列如下:

RegⅢγ-F:CCGTGCCTATGGCTCCTATTG,

RegⅢγ-R:GCACAGACACAAGATGTCCTG;

My D88-F:TCATGTTCTCCATACCCTTGGT,

My D88-R:AAACTGCGAGTGGGGTCAG;

IL-22-F:ATGAGTTTTTCCCTTATGGGGAC,

IL-22-R:GCTGGAAGTTGGACACCTCAA;

IL-12p40-F:TGGTTTGCCATCGTTTTGCTG,

IL-12p40-R:ACAGGTGAGGTTCATGTTTCT;

IL-23p19-F:CAGCAGCTCTCTCGGAATCTC,

IL-23p19-R:TGGATACGGGGCACATTATTTTT;

IL-17a-F:TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA,

IL-17a-R:CTTTCCCTCCGCGCATTGACAC。

內(nèi)參基因 gapdh-F:CACTCACGGCAAATTCAACGGCAC,gapdh-R:GACTCCACGACATACTCAGCA。Step One Plus軟件通過2－ΔΔCt值法計算試驗(yàn)中各組基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 RegⅢγ蛋白免疫熒光試驗(yàn) 小鼠腸道經(jīng)福爾馬林固定18 h后進(jìn)行石蠟包埋,制備厚度為4μm的石蠟切片,經(jīng)脫蠟后用10%小牛血清進(jìn)行阻斷。阻斷后樣品滴加兔抗鼠RegⅢγ一抗(1∶500稀釋度,Bioss)4℃孵育過夜,然后滴加二抗(山羊抗兔Ig G,1∶250稀釋度,Bioss)室溫染色30 min,最后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,SIGMA)室溫染色20 min。使用熒光顯微鏡(OLYMPUS IX51)觀察各組樣品熒光強(qiáng)度。

1.2.4 ELISA 試驗(yàn) 取小鼠小腸與結(jié)腸,37℃培養(yǎng)24 h[14],然后使用My D88、IL-22、IL-17 ELISA 試劑盒(R&D)檢測腸道小腸與結(jié)腸中MyD88、IL-22、IL-17蛋白表達(dá)。

1.2.5 組織學(xué)評估 取小鼠小腸與結(jié)腸組織,制成石蠟切片,并對切片進(jìn)行HE 染色以分析小腸和結(jié)腸中炎癥情況。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,并通過T檢驗(yàn)確定試驗(yàn)數(shù)據(jù)是否具有統(tǒng)計意義。P＜0.05,數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌定植小腸與結(jié)腸中RegⅢγ表達(dá)水平

考慮到胃腸道的不同區(qū)域由于其細(xì)胞型、微生物成分等存在差別[14],因此本試驗(yàn)檢測乳酸菌定植后小腸與結(jié)腸中RegⅢγ的表達(dá)情況,以確定乳酸菌在不同的腸道區(qū)域是否都能誘導(dǎo)RegⅢγ的表達(dá)。小鼠口服灌胃混合乳酸菌(3×109CFU/m L)2 周后,小鼠從單獨(dú)的隔離器中取出,獲取小鼠腸道組織以檢測RegⅢγ的表達(dá)。通過RT-qPCR 我們成功地在小鼠小腸與結(jié)腸中檢測到RegⅢγ mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示混合乳酸菌在小腸與結(jié)腸中其誘導(dǎo)RegⅢγ表達(dá)的能力基本相同(圖1)。免疫熒光顯示(圖2)小鼠服用混合乳酸菌后其小腸與結(jié)腸RegⅢγ 蛋白熒光強(qiáng)度明顯高于對照組小鼠,與RTqPCR 結(jié)果一致。因此研究表明乳酸菌定植腸道后不受腸道區(qū)域情況限制都能夠誘導(dǎo)RegⅢγ的表達(dá)。

圖1 SPF小鼠和乳酸菌定植小鼠小腸及結(jié)腸中RegⅢγm RNA 的表達(dá) ??.P≤0.01;???.P≤0.005。下同

圖2 SPF小鼠3種混合乳酸菌定植小鼠小腸及結(jié)腸中RegⅢγ蛋白表達(dá)

2.2 乳酸菌定植數(shù)量與RegⅢγ表達(dá)水平的關(guān)系為了確定RegⅢγ表達(dá)水平是否與乳酸菌定植量相關(guān),使用高、低2 種劑量(1×1010和1×109CFU/m L)的乳酸菌灌胃小鼠。2種劑量的乳酸菌連續(xù)在小鼠腸道定植2周后小鼠腸道中乳酸菌定植量呈現(xiàn)顯著性差異。通過RT-qPCR 檢測小鼠小腸與結(jié)腸中RegⅢγ的表達(dá)水平,結(jié)果顯示服用高劑量乳酸菌的小鼠與低劑量組和對照組相比其小腸與結(jié)腸組織中RegⅢγ m RNA 表達(dá)水平顯著增加(圖3)。免疫熒光分析結(jié)果表明,與低劑量組和對照組相比,高劑量組的小腸與結(jié)腸中RegⅢγ蛋白表達(dá)也顯著增強(qiáng)(圖4)。

圖3 SPF小鼠和不同劑量乳酸菌定植的小鼠小腸及結(jié)腸中RegⅢγ的表達(dá)

圖4 SPF小鼠不同劑量3種混合乳酸菌定植小鼠小腸及結(jié)腸中RegⅢγ蛋白表達(dá)

2.3 乳酸菌誘導(dǎo)腸道RegⅢγ表達(dá)的主要途徑為了檢測乳酸菌誘導(dǎo)RegⅢγ表達(dá)的主要途徑,小鼠口服灌胃混合乳酸菌,取小鼠小腸及結(jié)腸組織并通過RTqPCR檢測腸道MyD88及IL-22、IL-17等Th17細(xì)胞因子反應(yīng)情況。結(jié)果顯示乳酸菌的定植能夠誘導(dǎo)小鼠小腸與結(jié)腸中MyD88顯著表達(dá),同時在一定程度上還能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生。乳酸菌能夠誘導(dǎo)IL-23、IL-22及IL-17的產(chǎn)生,但是隨著乳酸菌劑量的增多Th17細(xì)胞反應(yīng)并不明顯增強(qiáng),高劑量組與低劑量組IL-23、IL-22及IL-17表達(dá)水平基本維持在相近水平,但是整體均低于MyD88表達(dá)水平,同時ELISA結(jié)果顯示MyD88蛋白水平高于Th17細(xì)胞因子水平與RT-qPCR結(jié)果一致(圖5～6)。這表明乳酸菌主要通過MyD88特異性誘導(dǎo)途徑介導(dǎo)RegⅢγ表達(dá),同時對Th17細(xì)胞起到雙向調(diào)控作用以維護(hù)腸道健康,HE染色結(jié)果驗(yàn)證了乳酸菌的定植雖然在一定范圍內(nèi)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞反應(yīng)但各組腸道均沒有出現(xiàn)炎癥癥狀(圖7)。

圖5 SPF小鼠和不同劑量乳酸菌定植的小鼠小腸及結(jié)腸中MyD88的表達(dá)

圖6 SPF小鼠和不同劑量混合乳酸菌定植的小鼠小腸及結(jié)腸中Th17細(xì)胞因子的表達(dá)

圖7 SPF小腸及結(jié)腸H&E染色切片 A.小腸;B.結(jié)腸

3 討論

抗菌肽RegⅢγ蛋白通過調(diào)節(jié)宿主腸道上皮與微生物之間的空間位置關(guān)系繼而產(chǎn)生潛在的免疫防御以抵御病原微生物的入侵,因此RegⅢγ在維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)RegⅢγ不僅能夠殺滅入侵的微生物,同時腸道微生物還能夠影響腸道中RegⅢγ的表達(dá)水平[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)RegⅢγ表達(dá)水平與乳酸菌定植及劑量相關(guān)。SPF級BALB/c小鼠服用由3種乳酸菌組成的混合益生菌在腸道定植后能夠誘導(dǎo)小腸與結(jié)腸中RegⅢγ的表達(dá),同時不同乳酸菌定植量誘導(dǎo)的RegⅢγ表達(dá)水平也顯著不同,服用高劑量混合乳酸菌的小鼠與低計量乳酸菌組相比其小腸與結(jié)腸中RegⅢγ表達(dá)水平顯著增高。這表明腸道中RegⅢγ的表達(dá)水平與乳酸菌的定植量相關(guān),同時服用高劑量乳酸菌誘導(dǎo)RegⅢγ表達(dá)水平的增高也說明乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提首先是要大量的定植。研究表明,腸道中潘氏細(xì)胞作為小腸特征性細(xì)胞能夠分泌抗菌肽RegⅢγ,并且潘氏細(xì)胞在小腸中從十二指腸到回腸細(xì)胞數(shù)量呈逐漸增多現(xiàn)象,而在結(jié)腸中由于黏液層較厚不存在或少量存在潘氏細(xì)胞[16]。本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)乳酸菌在小腸與結(jié)腸中其對RegⅢγ的誘導(dǎo)能力大致相同,結(jié)合已有研究證實(shí)的雙歧桿菌主要通過激活TLR2/My D88信號途徑繼而誘導(dǎo)RegⅢγ的表達(dá)、腸道中RegⅢγ的表達(dá)受IL-22的調(diào)控以及小鼠注射鞭毛蛋白后當(dāng)腸道固有層中的樹突狀細(xì)胞識別到抗原后迅速產(chǎn)生IL-23繼而誘導(dǎo)腸道固有淋巴細(xì)胞分泌IL-22,IL-22促使上皮細(xì)胞修復(fù)的同時誘導(dǎo)RegⅢγ 的表達(dá)等基礎(chǔ)研究[17]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠服用高、低劑量混合乳酸菌后在小腸與結(jié)腸中My D88 表達(dá)水平顯著增多,并且高劑量組My D88 表達(dá)水平高于低劑量組,表明乳酸菌能夠激活MyD88信號途徑,同時IL-23、IL-22及IL-17等Th17細(xì)胞因子表達(dá)水平出現(xiàn)一定的增高,但是腸道結(jié)構(gòu)并沒有被破壞,也沒有產(chǎn)生炎癥反應(yīng),這表明乳酸菌能夠雙向調(diào)控Th17反應(yīng),既在一定程度上誘導(dǎo)Th17細(xì)胞反應(yīng)又嚴(yán)格控制過度的Th17反應(yīng),其原因可能為機(jī)體適應(yīng)性免疫成分控制RegⅢγ劇烈表達(dá)從而使益生菌在腸道定植。因此,乳酸菌誘導(dǎo)RegⅢγ的表達(dá)主要是受My D88途徑的調(diào)節(jié),

鑒于混合乳酸菌對RegⅢγ 的調(diào)節(jié)主要通過My D88途徑特異性誘導(dǎo)表達(dá),同時混和乳酸菌對Th17反應(yīng)具有雙向調(diào)控作用,既誘導(dǎo)其一定的表達(dá)又控制過度的炎癥反應(yīng),其中Th17中的細(xì)胞因子IL-22對RegⅢγ的表達(dá)也具有一定的促進(jìn)作用,與乳酸菌的定植對腸道炎癥性疾病的發(fā)生具有預(yù)防作用的研究結(jié)論吻合[18]。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)推斷,乳酸菌可能通過增加腸道中RegⅢγ的表達(dá)以加強(qiáng)腸道上皮的屏障功能以阻止病原菌的侵入及預(yù)防腸道炎癥性疾病的發(fā)生。同時本研究提出這樣的假設(shè),乳酸菌通過刺激腸道上皮固有免疫反應(yīng)來維護(hù)腸道健康從而實(shí)現(xiàn)了抑制炎癥,因此推測乳酸菌通過介導(dǎo)My D88特異性誘導(dǎo)RegⅢγ表達(dá)以維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,可能對炎癥性腸道疾病的研究提供一項新的治療策略.