鄭博偉,劉亞靜,張澤財(cái),衣 帆,王瑋玉,蔡夢(mèng)露,王浴光,王新平,2? (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)

學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130062;2.教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 吉林 長(zhǎng)春130062)

酵母雙雜交系統(tǒng)是利用酵母轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)功能特性,通過(guò)2個(gè)重組蛋白在酵母細(xì)胞中因相互作用而靠近,進(jìn)而引起下游報(bào)告基因的激活來(lái)捕獲新蛋白的一種試驗(yàn)方法。1989 年,FIELD 和SONG等[14]首次提出酵母雙雜交系統(tǒng)。真核生物轉(zhuǎn)錄因子GAL4包含2個(gè)結(jié)構(gòu)上互相獨(dú)立但功能上卻息息相關(guān)的結(jié)構(gòu)域:DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain,AD)。BD 可和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)特異性結(jié)合,AD可以激活UAS下游的基因。但是單獨(dú)的BD 或AD都不能發(fā)揮作用,只有BD 和AD 因相互作用而發(fā)生空間上的靠近才能激活下游的報(bào)告基因,進(jìn)而通過(guò)缺陷型培養(yǎng)基和顯色反應(yīng)即可篩選到陽(yáng)性菌落。

BEV 感染是近年來(lái)國(guó)內(nèi)新發(fā)傳染病,對(duì)其致病機(jī)理及如何誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的研究鮮有報(bào)道[7]。本試驗(yàn)以E種腸道病毒HY12毒株編碼的VP1蛋白為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)MDBK 細(xì)胞的cDNA 文庫(kù)進(jìn)行篩選,初步發(fā)現(xiàn)與HY12-VP1相互作用的潛在蛋白,為后續(xù)研究VP1 蛋白在BEV感染過(guò)程中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及載體HY12病毒株為本實(shí)驗(yàn)室從長(zhǎng)春某牛場(chǎng)暴發(fā)的1起疫病中首次分離到的1株E種腸道病毒,－80℃保存。牛腎細(xì)胞(MDBK)、E.coliTOP10 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母菌株AH109、Y187,質(zhì)粒p GBKT7、p GADT7、p GBKT7-P53、pGBKT7-Lam 由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。大腸桿菌E.coliTOP10感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室制備,－80℃保存。

1.2 主要試劑DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、3AT 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ、rTaq酶、T4DNA 連接酶等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;PEG3350、DMSO、X-αgal、鮭魚精DNA、Li Ac、YNB 及各種氨基酸購(gòu)自Sigma公司;異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品;DMEM 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清購(gòu)自上?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司;Reverse Transcriptase M-MLV 試劑盒購(gòu)自Ta KaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞與病毒的培養(yǎng) 使用含有5%胎牛血清(FBS)的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)MDBK 細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí),接種HY12病毒液并培養(yǎng)至50%～70%細(xì)胞出現(xiàn)病變。

1.3.2 RNA 提取與PCR 擴(kuò)增VP1基因序列 以TRIzol試劑盒提取接毒細(xì)胞的總RNA,然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取到的RNA 反轉(zhuǎn)錄成c DNA。引物的設(shè)計(jì)參照HY12結(jié)構(gòu)蛋白VP1的基因序列進(jìn)行。引物由上海生工生物工程公司合成,

其次，在“綠色原則”作為物權(quán)人需承擔(dān)環(huán)保義務(wù)的一般性條款在“物權(quán)編”總則中確立的情況下，“物權(quán)編”分則的制度構(gòu)建及規(guī)范解釋在強(qiáng)調(diào)物權(quán)之經(jīng)濟(jì)價(jià)值的同時(shí)，必須對(duì)物權(quán)之生態(tài)環(huán)境功能進(jìn)行重新考量和定位，并在具體制度構(gòu)建中盡力給出二者沖突時(shí)的解決規(guī)則和取舍標(biāo)準(zhǔn)。一方面，這需要將《物權(quán)法》中已蘊(yùn)含“綠色原則”理念的私法規(guī)范進(jìn)行規(guī)則整合，實(shí)現(xiàn)“‘綠色原則’規(guī)則化”，避免在個(gè)案中缺少基本規(guī)范而“向基本原則逃避”；另一方面，在承繼《物權(quán)法》已蘊(yùn)含“綠色原則”既有規(guī)范前提下，將更多蘊(yùn)含此種理念的制度規(guī)范納入《民法典》“物權(quán)編”中，使“綠色原則”轉(zhuǎn)變?yōu)榭刹僮鞯木唧w物權(quán)規(guī)范。

上游引物:5′-CGCGGATCCGCGTCTCTCATCGGTGG-3′;

下游引物:5′-CCGGAATTCCATCTGGTAGTTGGTCTCTAGTCA-3′,擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物以1%瓊脂糖進(jìn)行鑒定。

1.3.3 酵母誘餌重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物以EcoRⅠ和Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,并將其連接到誘餌載體pGBKT7 的EcoRⅠ/Bam HⅠ酶切位點(diǎn)上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中,冰浴30 min,放入42℃水浴鍋中熱激70 s,冰浴4 min后,加入1 m L LB液體培養(yǎng)基,于37℃搖床振蕩培養(yǎng)(200 r/min)1 h后,取100μL 菌液,均勻涂布在卡那霉素抗性的LB 瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單個(gè)菌落,進(jìn)行培養(yǎng),抽提質(zhì)粒,然后利用EcoRⅠ和Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定后的重組質(zhì)粒命名為p GBKT7-VP1。

1.3.4 AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 從YPDA瓊脂平板上挑取新鮮的AH109單克隆菌落至2 m L YPDA 培養(yǎng)基中,于30℃以200 r/min 振蕩培養(yǎng)17 h 后,吸取1 m L 菌液,置于50 m L YPDA 液體培養(yǎng)基中,于30℃搖床中200 r/min 搖至D600＞1.5。取適量菌液加入到300 m L YPDA 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至D600＝0.5;3 000 r/min 離心收菌,加 入40 m L dd H2O 或TE重新洗滌酵母沉淀細(xì)胞,重復(fù)洗2次。最后以1 m L 1×TE/LiAc溶液懸浮沉淀菌體,即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.3.5 誘餌重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株 取1個(gè)1.5 m L的EP管,加入0.1μg pGBKT7-VP1 和10μg預(yù)處理過(guò)的鮭魚精DNA,混合均勻,再加入100μL的酵母感受態(tài)細(xì)胞,吹吸混勻,繼續(xù)加入600μL PEG/LiAc,劇烈振蕩混勻,于30℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)30 min。取出搖床中的EP 管,加入50μL DMSO輕柔混勻,于42℃水浴鍋中加熱15 min,冰浴3 min。離心收菌后,用0.5 m L 的TE 重懸酵母細(xì)胞。吸取150μL 菌液,均勻涂布在固體SD/-Trp培養(yǎng)平皿上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d,p GBKT7空質(zhì)粒作為對(duì)照組。

1.3.6 誘餌重組質(zhì)粒的自激活活性及毒性檢測(cè) 取30μL無(wú)菌水懸浮pGBKT7-VP1單菌落,分別接種 于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培養(yǎng)平皿上。封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)1 d觀察結(jié)果,pGBKT7空質(zhì)粒作為對(duì)照組。挑取單個(gè)菌落接種于4 m L 的YPDA 液體培養(yǎng)基中,置于30℃、200 r/min搖床中振蕩培養(yǎng),比較試驗(yàn)組和對(duì)照組不同時(shí)間菌液的D600值。

1.3.7 cDNA 文庫(kù)滴度和豐度檢測(cè) 吸取1 m L文庫(kù)菌液依次做10的倍比稀釋(101～105),分別取不同稀釋倍數(shù)的菌液100μL,均勻涂布在SD/-Leu固體培養(yǎng)平皿上,封口后于30℃培養(yǎng)3～5 d,確定菌落數(shù)量,計(jì)算文庫(kù)滴度。文庫(kù)滴度按公式以N×稀釋倍數(shù)/涂板菌液體積進(jìn)行計(jì)算。從SD/-Leu固體培養(yǎng)平皿上隨機(jī)挑選44 個(gè)菌落,分別溶于20μL dd H2O 中,反復(fù)凍融后以12 000 r/min離心5 min,取其上清液作為模板,并以文庫(kù)通用引物進(jìn)行PCR。

1.3.8 文庫(kù)菌與誘餌菌的雜交 挑取單個(gè)新鮮培養(yǎng)的誘餌菌接種到50 m L SD/-Trp液體培養(yǎng)基中。于30℃、200 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)16 h至D600＝0.8。離心收菌,棄掉上清,用4～5 m L SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸酵母細(xì)胞沉淀。將1 m L 文庫(kù)菌和4～5 m L誘餌菌在無(wú)菌錐形瓶中混合。在錐形瓶中加入45 m L 2×YPDA 液體培養(yǎng)基混合均勻。用1 m L 2×YPDA 液體培養(yǎng)基沖洗文庫(kù)管2次,沖洗液加入到2 L錐形瓶中。于30℃、30～50 r/min搖床中緩慢振蕩培養(yǎng)20～24 h,直至出現(xiàn)三葉草結(jié)構(gòu)狀的結(jié)合子。在顯微鏡下觀察到結(jié)合子出現(xiàn)時(shí)終止培養(yǎng),離心收菌。用0.5×YPDA 液體培養(yǎng)基沖洗錐形瓶,重懸離心后收集到的細(xì)胞,棄上清。重復(fù)沖洗、離心的步驟2次,最后用10 m L 0.5×YPDA 液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將10 m L細(xì)胞懸液全部涂布于150 mm DDO 平板,每個(gè)平板均勻涂布200μL,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d。將DDO平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)涂到QDO 平板上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。再將QDO 平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)涂至QDO/X/A 平板上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。

1.3.9 酵母雙雜交陽(yáng)性克隆的鑒定 用酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提所有在QDO/X/A 平板上變藍(lán)的克隆。將抽提的酵母混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞中,均勻涂布在氨芐抗性的LB瓊脂板上,挑取單克隆,用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒,以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,陽(yáng)性樣品送公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析,確定潛在的互作宿主蛋白。將抽提的陽(yáng)性大腸桿菌質(zhì)粒與構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒p GBKT7-VP1 共同轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中。設(shè)置陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、試驗(yàn)組(p GBKT7-VP1和陽(yáng)性質(zhì)粒共轉(zhuǎn))。將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在DDO 平板上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。將DDO 平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)涂到QDO 平板上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d。再將QDO 平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)涂至QDO/X/A 平板上,封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pGBKT7-VP1的構(gòu)建與酶切鑒定利用1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)觀察基因擴(kuò)增結(jié)果,發(fā)現(xiàn)PCR 擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的846 bp目的片段(圖1A)。挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化后的菌落,利用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒,然后用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和EcoRⅠ對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),出現(xiàn)1 條846 bp 左右的目的條帶和1 條7 300 bp左右的pGBKT7載體片段即為陽(yáng)性質(zhì)粒(圖1B),結(jié)果顯示2 號(hào)質(zhì)粒為構(gòu)建成功的p GBKT7-VP1誘餌質(zhì)粒,將質(zhì)粒送至上海生工生物工程公司測(cè)序,進(jìn)一步確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pGBKT7-VP1的構(gòu)建與酶切鑒定 A.VP1基因的擴(kuò)增結(jié)果;B.重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定;Ma.DL2000 DNA Ladder Marker;N.VP1 基因;Mb.DL15000 DNA Ladder Marker;1～5.構(gòu)建的重組質(zhì)粒酶切樣品

2.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-VP1對(duì)酵母細(xì)胞的毒性驗(yàn)證對(duì)分別含有p GBKT7-VP1和p GBKT7質(zhì)粒的AH109菌株的D600值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果菌株的D600值在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異(圖2),表明重組質(zhì)粒p GBKT7-VP1對(duì)酵母細(xì)胞AH109無(wú)毒性作用。

圖2 包含不同質(zhì)粒的AH109酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 重組質(zhì)粒pGBKT7-VP1的自激活活性驗(yàn)證將p GBKT7-VP1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母AH109 菌株中,均勻涂布在SD/-Trp固體平皿上,挑取單菌落,用30μL 無(wú)菌水充分懸浮,涂布在固體SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)平皿上。封口倒置在30℃酵母培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。結(jié)果如圖3所示,菌株在SD/-Trp培養(yǎng)平皿上可以正常生長(zhǎng),而在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)平皿上均沒有生長(zhǎng),說(shuō)明重組質(zhì)粒沒有自激活活性。

圖3 誘餌質(zhì)粒的自激活活性檢測(cè) A.SD/-Trp固體培養(yǎng)皿;B.SD/-Trp/-Leu 固 體 培 養(yǎng) 皿;C.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)皿

2.4 cDNA 文庫(kù)滴度與豐度檢測(cè)將文庫(kù)菌液做10的倍比稀釋后,取各個(gè)稀釋度菌液100μL,涂布在SD/-Leu固體平皿上,計(jì)算每個(gè)滴度生長(zhǎng)的酵母克隆數(shù)。通過(guò)計(jì)算,確定文庫(kù)滴度為108CFU/m L。隨機(jī)挑取平皿上44個(gè)克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,插入片段大小范圍為200～2 000 bp,說(shuō)明文庫(kù)多態(tài)性良好,豐度較高,符合試驗(yàn)要求,可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 cDNA 文庫(kù)插入片段電泳圖 M.DL2000 DNA Ladder Marker;1～44.隨機(jī)挑取的單克隆

2.5 陽(yáng)性克隆的篩選將含有MDBK 細(xì)胞基因組文庫(kù)的菌株與含有誘餌質(zhì)粒的菌株混合培養(yǎng)后,進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn),培養(yǎng)16 h后,取菌液滴于載玻片。顯微鏡觀察到大量米奇頭樣(圖5)的結(jié)合子,表明雜交成功。

圖5 酵母雙雜交中的結(jié)合子

文庫(kù)菌與誘餌菌雜交后,于QDO 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)72 h后,將生長(zhǎng)的菌落點(diǎn)涂至QDO/X/A 培養(yǎng)皿上,直至克隆變藍(lán)(圖6)。

圖6 QDO/X/A 培養(yǎng)皿檢測(cè)篩選結(jié)果

2.6 陽(yáng)性酵母克隆質(zhì)粒的PCR 及測(cè)序鑒定將顯色變藍(lán)的克隆進(jìn)行質(zhì)粒的抽提,并以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,結(jié)果擴(kuò)增出大小不一的片段(圖7)。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序測(cè)定與分析,獲得12 個(gè)候選蛋白(表1)。

圖7 陽(yáng)性酵母克隆質(zhì)粒的PCR 結(jié)果 M.DL2000 DNA Ladder Marker;1～12.陽(yáng)性酵母克隆

3 討論

BEV 屬于小RNA 病毒科,其編碼的前體多聚蛋白經(jīng)降解可產(chǎn)生VP1、VP2、VP3和VP4 4種結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP3是病毒最先編碼的3個(gè)蛋白,含有中和抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn)。研究表明,VP1～VP3與病毒感染和病毒血清型的分類密切相關(guān)[15-17]。結(jié)構(gòu)蛋白VP1位于病毒粒子的表面,帶有大量的中和抗原決定簇,直接決定著病毒的抗原性,在感染宿主細(xì)胞過(guò)程中,發(fā)揮了極其重要的作用[18-19]。目前,有關(guān)VP1蛋白功能的研究主要集中于小RNA 病毒科中脊髓灰質(zhì)炎病毒、EV71、口蹄疫病毒等,但有關(guān)BEV 致病機(jī)理的研究較為缺乏。

表1 篩選出HY12-VP1的潛在互作蛋白基因

目前,篩選互作蛋白的方法眾多,但由于酵母雙雜交技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、易于操作等優(yōu)點(diǎn),因此本研究選擇該方法來(lái)篩選HY12毒株VP1蛋白的互作蛋白。將真核生物轉(zhuǎn)錄因子的2個(gè)結(jié)構(gòu)域與不同蛋白進(jìn)行融合表達(dá):BD 與誘餌蛋白融合表達(dá),即構(gòu)建誘餌重組蛋白的質(zhì)粒;AD 與文庫(kù)蛋白融合表達(dá),即構(gòu)建文庫(kù)重組蛋白的質(zhì)粒[20],將這2種重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109 中。由于酵母菌株AH109在正常情況下不能合成亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)與腺嘌呤(Ade),因此無(wú)法在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),只有當(dāng)誘餌重組蛋白與文庫(kù)重組蛋白因相互作用而在空間上靠近時(shí),BD 和AD 在空間上也相互靠近從而使得轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而激活下游報(bào)告基因HIS3、LACZ等的表達(dá)[21]。

本試驗(yàn)應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),初步篩選了HY12-VP1蛋白的互作的蛋白。成功構(gòu)建了重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP1并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證該重組誘餌質(zhì)粒無(wú)自激活活性和細(xì)胞毒性。將重組質(zhì)粒的酵母菌株與文庫(kù)菌株進(jìn)行混合培養(yǎng),初步篩選到12個(gè)陽(yáng)性克隆,即候選蛋白。這些候選蛋白的功能各不相同,如鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(Ca MK)是一種依賴于鈣/鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在腦組織中參與神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)[22];熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)在蛋白質(zhì)折疊、裝配、加工等多種生物水平的活動(dòng)中發(fā)揮了極其重要的作用[23]。熱休克蛋白表達(dá)量的上升,則可以通過(guò)影響癌細(xì)胞在基因水平上的轉(zhuǎn)錄,從而提高癌細(xì)胞的黏附能力浸潤(rùn)現(xiàn)象的發(fā)生[24]。在候選蛋白中,P21 活化蛋白激酶1(p21-activated protein kinases,PAK1)屬于絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族[25]。據(jù)報(bào)道,多種刺激因子可以激活PAK1,從而引起下游信號(hào)分子的活化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26],進(jìn)而影響病毒的毒力和致病性。本研究初步確定出VP1與PAK1互作,表明PAK1很可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡影響病毒的復(fù)制,但具體機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。此外,ZC3H11A 即CCCH 型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(Zinc-finger Antiviral Protein,ZAP)可以特異性的與靶點(diǎn)結(jié)合來(lái)識(shí)別核酸和蛋白質(zhì)、調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用[27]。ZAP在宿主細(xì)胞內(nèi)可發(fā)揮抗病毒作用。首先,ZAP可與靶病毒m RNA 的特異性序列結(jié)合,使得宿主細(xì)胞的核酸外切酶復(fù)合體Exosome 從3′端降解病毒的m RNA[28],同時(shí),ZAP 還可以利用p72(RNA 解旋酶)去除病毒m RNA 上的帽子結(jié)構(gòu)[29]。其次,在病毒翻譯的過(guò)程中,eIF4A 翻譯起始因子和eIF4G 翻譯起始因子會(huì)產(chǎn)生互作,ZAP卻與eIF4A 結(jié)合來(lái)影響eIF4A 和eIF4G 的互作,進(jìn)而抑制了病毒m RNA的翻譯,一定程度上起到了抗病毒感染的作用[30-31]。因此,我們預(yù)測(cè)過(guò)表達(dá)ZAP可以在一定意義上減少病毒感染。綜上所述,本試驗(yàn)應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出12個(gè)VP1的可能互作蛋白,為后續(xù)腸道病毒感染機(jī)制及誘發(fā)機(jī)體免疫的相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。