高倩文,孫 舉,尹燕博,徐守振 (青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島266109)

血清4型Ⅰ群禽腺病毒(group Ⅰfowl adenovirus serotype 4,FAd V-4)感染,是以雞包涵體肝炎和心包積液為主要臨床癥狀的雞急性傳染病,臨床上又稱“雞心包積液-肝炎綜合征”[1],該病發(fā)病急,傳播速度快,主要感染4～8周齡雞,感染后病死率可達(dá)40%～90%[2],該病的發(fā)生給養(yǎng)雞業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究表明高免卵黃抗體對該病有明顯的預(yù)防和治療效果[3],但卻存在生產(chǎn)工藝繁瑣、環(huán)境污染等問題。近年來基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展,為抗體生產(chǎn)技術(shù)開拓了一個新局面,尤其以噬菌體展示研發(fā)靶動物源化基因工程抗體的技術(shù),發(fā)展最為迅速[4]。該技術(shù)已經(jīng)在豬[5]、犬[6]、禽[7]等抗體研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。到目前為止,國內(nèi)外尚未見有關(guān)FAd V-4 基因工程單克隆抗體研究的報道。因此制備FAd V-4 特異性基因工程單克隆抗體,省去了養(yǎng)雞、免疫、收集高免蛋卵黃液提純抗體等繁瑣過程,更符合低碳、環(huán)保的現(xiàn)代理念[8],對預(yù)防和治療雞心包積液-肝炎綜合征具有積極意義。本研究通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建雞源抗FAd V-4基因工程抗體文庫,篩選出與FAd V-4結(jié)合的單鏈抗體,為雞心包積液-肝炎綜合征的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、質(zhì)粒與試劑XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室制備,pComb3XSS 載體由中國科學(xué)院微生物所惠贈;雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒、TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol、PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、T4DNA 連接酶購自寶生物(大連)工程有限公司;限制性內(nèi)切酶SfiⅠ、M13K07 輔助噬菌體購自NEB(美國)生物工程公司;微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物根據(jù)Gen Bank中登錄的雞抗體基因序列,分別在保守區(qū)域設(shè)計1對擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL)的簡并引物。在重鏈VH5′端和輕鏈VL3′端插入部分Linker片段(斜體部分),在重鏈VH3′端和輕鏈VL5′端插入SfiⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線部分),引物序列見表1,由睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 抗體可變區(qū)基因擴(kuò)增引物及擴(kuò)增片段大小

1.3 動物與免疫以60日齡SPF來航雞為試驗動物,采用皮下注射進(jìn)行免疫,免疫原為滅活純化的FAd V-4疫苗;第1次免疫使用弗氏完全佐劑,劑量為1.0 m L/只,第2,3,4次免疫使用弗氏不完全佐劑,劑量為1.5 m L/只,每次免疫間隔時間為14 d。

1.4 免疫血清抗體效價的測定第4次免疫結(jié)束后7 d翅靜脈采血,離心收集抗血清,采用瓊脂擴(kuò)散試驗檢測血清抗體效價,抗體效價在1∶24以上的為免疫合格試驗動物[9]。

1.5 外周血淋巴細(xì)胞的分離及總RNA 的提取取雞外周血,按照Solarbio雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒說明書分離淋巴細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,用超微量分光光度計測定其濃度及A260/A280比值,分析其純度;1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。

1.6 VH 和VL 基因的擴(kuò)增以提取的總RNA 為模板,按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,以cDNA 為 模 板PCR 擴(kuò) 增VH和VL基 因。反應(yīng)體系:1× PCR Mix 18μL,上、下游引物各0.5μL,cDNA 1μL;反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,35個循環(huán);72℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,回收純化VH和VL片段。

1.7 重組sc Fv 基因的構(gòu)建以純化的VH和VL片段為模板,通過SOE-PCR 將含有Linker序列的VH和VL基因連接成sc Fv基因,將等量的VH和VL加到PCR 反應(yīng)體系中,反應(yīng)程序同1.6。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化目的片段。

1.8 scFv與pComb3XSS載體的連接用SfiⅠ分別酶切scFv基因和p Comb3XSS載體,酶切后進(jìn)行膠回收,將回收的sc Fv與pComb3XSS用T4連接酶進(jìn)行16℃過夜連接,連接體系為:sc Fv 1.5μL,p Comb3XSS 2.0μL,T4DNA Ligase 1.0μL,10×T4DNA Ligase Buffer 1.0μL,dd H2O 4.5μL。

1.9 scFv抗體文庫的構(gòu)建將20μL 連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至80μL XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中,電擊后加入1 m L SOC 培養(yǎng)基,37℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,取20μL菌液涂在含Amp(100 mg/L)的平板上,檢測連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。向菌液中加入9 m L 含Amp和葡萄糖的培養(yǎng)基,37℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)至D600＝0.5。加入M13K07輔助噬菌體進(jìn)行感染,振蕩培養(yǎng)1 h。離心去除培養(yǎng)基,用等體積含100 mg/L Amp,50 mg/L Kana,1 mol/L IPTG 的培養(yǎng)基重懸菌體,220 r/min過夜培養(yǎng);離心收集上清,向上清中加入NaCl/PEG8000沉淀噬菌體,4℃過夜后離心,棄上清,用PBS 重懸沉淀,上清即為scFv抗體初級文庫。

1.10 scFv抗體文庫滴度的測定取1μL scFv抗體文庫,用PBS進(jìn)行10倍比稀釋,從10－7～10－9稀釋度的液體中各取出20μL 加入到180μLD600＝0.5的XL1-Blue菌液中,感染30 min。各取20μL菌液涂在含有Amp的LB 平板上,37℃培養(yǎng)過夜,次日計算菌落數(shù)。

1.11 scFv抗體文庫的富集淘篩用50 mmol/L Na HCO3(p H9.6)溶液將純化的FAd V-4包被在酶標(biāo)板上,每孔100μL,4℃過夜;次日棄去包被液,每孔加入100μL封閉液37℃封閉2 h,棄去封閉液,用PBST 洗 滌3 次;每 孔 加 入100μL scFv 抗 體,37℃孵育1 h;PBST 洗滌3次后加入洗脫液,洗脫吸附在酶標(biāo)板孔中的產(chǎn)物,用中和緩沖液進(jìn)行中和,取1μL液體進(jìn)行抗體文庫滴度測定,剩余液體感染XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞,在輔助噬菌體M13K07的作用下產(chǎn)生大量噬菌體,即可制備出第1輪篩選后的scFv抗體文庫,取1μL抗體文庫進(jìn)行滴度測定,剩余的進(jìn)行下一輪篩選;重復(fù)以上富集篩選步驟,如此重復(fù)4輪。

1.12 Phage ELISA鑒定scFv抗體隨機(jī)挑取第4輪篩選的單克隆接種于5 m L LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至D600＝0.5,加入輔助噬菌體M13K07進(jìn)行拯救,用NaCl/PEG8000沉淀噬菌體,用PBS 重懸沉淀,獲得的上清即為單個克隆的scFv抗體,直接用于Phage ELISA 檢測。用50 mmol/L Na HCO3(p H9.6)溶液將1 000 TCID50的FAd V-4包被在酶標(biāo)板上,M13K07 為陰性對照,BSA 為空白對照,4℃過夜;次日加入封閉液37℃封閉2 h,用PBST洗滌3 次;加入單個克隆的sc Fv 抗體,37℃孵育2 h;PBST 洗滌3次,加入HRP 標(biāo)記的抗M13 酶標(biāo)二抗,37℃孵育1 h;PBST 洗滌3次,加入TMB顯色液,37℃反應(yīng)10 min;加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測D450讀值。

2 結(jié)果

2.1 免疫血清抗體效價測定結(jié)果第4次免疫結(jié)束后7 d采血,收集抗血清,采用瓊脂擴(kuò)散試驗檢測血清抗體效價,抗體效價為1∶25(圖1),說明試驗動物免疫合格。

2.2 VH 和VL 基因擴(kuò)增結(jié)果從免疫雞的外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA 為模板擴(kuò)增抗體的VH和VL基因,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,VH基因片段長度約為420 bp,VL基因片段長度約為390 bp(圖2),與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 FAd V-4瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果 a.2－5 FAd V-4血清;b.未稀釋FAd V-4血清;c.2－4 FAd V-4血清;d.FAd V-4病 毒;e.2－1 FAd V-4 血 清;f.2－3 FAd V-4 血 清;g.2－2 FAd V-4血清

圖2 VH 和VL 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.VH 基因PCR 產(chǎn)物;2.VL 基因PCR 產(chǎn)物

2.3 重組sc Fv 基因構(gòu)建結(jié)果以VH和VL基因為模板,通過SOE-PCR 擴(kuò)增引入Linker接頭構(gòu)建VL-Linker-VH片段,擴(kuò)增的目的片段大小約為850 bp(圖3),與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 sc Fv 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.sc Fv 基因PCR 產(chǎn)物

2.4 scFv抗體文庫驗證結(jié)果將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞中,電轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂板檢測轉(zhuǎn)化效率。從平板上隨機(jī)挑取12個菌落進(jìn)行PCR檢測,PCR產(chǎn)物條帶大小約為1 000 bp,轉(zhuǎn)化效率約為83%(圖4);隨機(jī)將PCR 檢測結(jié)果為陽性的菌液抽提質(zhì)粒,經(jīng)SfiⅠ酶切鑒定,在850 bp 位置處有特異性目的條帶(圖5)。

圖4 單鏈抗體文庫菌落PCR 擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～12.單克隆菌落

圖5 單鏈抗體文庫酶切驗證結(jié)果 M.DL5000 DNA Marker;1～8.酶切結(jié)果

2.5 scFv抗體文庫滴度測定結(jié)果通過細(xì)菌電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體文庫,采用抗體文庫容量鑒定方法,將10－7,10－8,10－93個稀釋度的菌液涂布在含Amp(100 mg/L)的LB 平板上,37℃培養(yǎng)過夜,估算出單鏈抗體原始文庫的庫容量為9.5 ×1010PFU/m L(圖6)。

圖6 單鏈抗體文庫構(gòu)建結(jié)果 A.10－7;B.10－8;C.10－9

2.6 scFv 抗體文庫富集淘篩結(jié)果以純化的FAd V-4為抗原,對構(gòu)建的單鏈抗體文庫進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-富集”篩選,每輪篩選做滴度測定。結(jié)果顯示(表2),富集后的抗體文庫滴度比初級抗體文庫提高了276倍,說明特異性噬菌體得到有效富集。

表2 單鏈抗體文庫的富集淘篩結(jié)果

2.7 Phage ELISA鑒定結(jié)果從第4輪淘篩庫中隨機(jī)挑選48 個scFv陽性單克隆進(jìn)行Phage ELISA鑒定,根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)[10],P/N＞2.1且P＞0.2為陽性,結(jié)果顯示4株單克隆為陽性,其中2和44號2株sc Fv抗體與FAd V-4親和活性較高(圖7),將這2株單克隆送至公司測序,序列比對分析發(fā)現(xiàn)這2株單克隆的基因序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列完全一致,最終篩選到1株與FAd V-4具有高親和力的單鏈抗體。

圖7 噬菌體抗體結(jié)合活性

3 討論

本研究采用的噬菌體展示靶動物源化基因工程抗體技術(shù),較傳統(tǒng)的單克隆抗體制備技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢[11]。研究中以雞抗體序列為參照設(shè)計特異性引物,構(gòu)建雞源抗FAd V-4單鏈抗體文庫,相對于傳統(tǒng)的鼠源單抗而言,省去細(xì)胞融合的步驟,避免了反復(fù)亞克隆的繁瑣程序。傳統(tǒng)單抗的篩選能力在上千個克隆以內(nèi),而噬菌體展示技術(shù)可篩選108以上個克隆,該技術(shù)可以使特異性抗體得到有效富集,能高度簡化篩選過程,增加篩選容量,擴(kuò)大篩選范圍[12]。

本研究構(gòu)建的雞源抗FAd V-4單鏈抗體文庫庫容為9.5×1010PFU/m L,一般而言構(gòu)建的抗體庫容越大,篩選得到特異性抗體的機(jī)率就越大。雞免疫后,抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),致使淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種不同的、并與之相適應(yīng)的特異性抗體,用免疫后的雞外周血淋巴細(xì)胞為抗體基因來源,不僅可以增加抗體庫的多樣性[13],而且更容易篩選到特異性的單鏈抗體。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率也是影響庫容的限制性因素,先前有文獻(xiàn)報道,采用CaCl2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率較低[9],因此本試驗采用轉(zhuǎn)化效率較高的細(xì)菌電轉(zhuǎn)化技術(shù),并通過多次電轉(zhuǎn)累積庫量?？偟膩碚f,本研究構(gòu)建的單鏈抗體文庫的陽性克隆率較高,多樣性較好。通過4 輪“吸附-洗脫-富集”篩選,采用Phage ELISA 方法鑒定抗FAd V-4單鏈抗體的特異性,在篩選過程中可能由于缺乏對某些操作過程具體條件的摸索,包括抗原的包被濃度,抗體的稀釋度以及洗滌次數(shù)等,導(dǎo)致在篩選過程中大量抗體鏈丟失,最終只篩選到1株與FAd V-4具有高親和力的單鏈抗體。后續(xù)我們將繼續(xù)優(yōu)化試驗條件,篩選出盡可能多的與FAd V-4具有較高親和力的單鏈抗體。

本研究成功構(gòu)建雞源抗FAd V-4 單鏈抗體文庫,并通過噬菌體展示技術(shù)篩選到1株與FAd V-4具有較高親和力的單鏈抗體,以期為雞心包積液-肝炎綜合征的診斷和治療提供幫助。