顏仁和,劉 蕾,王升堯,李安迪,萬鵬飛,仇珍珍,范根成,李紅衛(wèi),杜元釗?,高永新?
(1.廣州伯尼茲生物科技有限公司,廣東 廣州510663;2.青島易邦生物工程有限公司 動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266032;3.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院,廣東 廣州510515)
豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種以發(fā)熱、拉稀、腸道發(fā)炎為主要癥狀的急性接觸性傳染病,具有高度傳染性和致死性[1]。豬瘟仍然是當(dāng)前中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)大敵,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。免疫接種是防止豬瘟蔓延最有效的方法,豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用使得豬瘟的傳播得到了顯著控制[2]。然而近年來,我國(guó)豬瘟的流行形式和傳播特點(diǎn)發(fā)生了很大的改變,散發(fā)流行、發(fā)病幼齡化、非典型病例增多、傳播方式多樣化等發(fā)生特點(diǎn)使得豬瘟的免疫和防治面臨著新的挑戰(zhàn)[3]。目前,豬瘟流行地區(qū)或國(guó)家仍然采用接種弱毒疫苗的方法作為預(yù)防豬瘟的主要策略,其中由中國(guó)科學(xué)家研究成功的豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)是世界上公認(rèn)的最好的豬瘟疫苗,對(duì)世界范圍內(nèi)豬瘟防控做出了卓著貢獻(xiàn)。用豬瘟弱毒疫苗免疫的豬與自然感染豬瘟野毒的豬無法在免疫學(xué)上區(qū)分開來,顯然該疫苗將無法用于豬場(chǎng)凈化及豬瘟在我國(guó)的最終根除計(jì)劃,為了消滅豬瘟、凈化豬場(chǎng),新型標(biāo)記性疫苗的研究已迫在眉睫[4]。
目前研究較多的新型豬瘟疫苗主要包括基因工程亞單位疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗及活載體疫苗等。其中,基因工程亞單位疫苗因其安全、有效、便于操作等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的新型豬瘟疫苗[5]。囊膜糖蛋白E2是CSFV 的1個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,參與病毒感染過程,并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體對(duì)抗CSFV 野毒株,而且很容易通過檢測(cè)抗CSFV Erns蛋白的抗體來區(qū)分疫苗免疫豬和野生毒株感染豬,評(píng)估豬場(chǎng)清凈度,因此是豬瘟亞單位疫苗研制的首選結(jié)構(gòu)蛋白[6]。
獲得高純度的E2蛋白是E2亞單位疫苗研發(fā)的重要基礎(chǔ),目前,E2蛋白已經(jīng)在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá),包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)等[7]。本課題組在前期研究中建立了一種基于人胚腎細(xì)胞HEK-293T 的E2分泌性表達(dá)系統(tǒng),為豬瘟E2亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證E2亞單位疫苗的免疫效果。
1.1 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白的重組細(xì)胞系HEK-293T-E2由本公司構(gòu)建保存。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 培養(yǎng)基由Corning公司生產(chǎn);胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞生長(zhǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。
1.3 檢測(cè)試劑盒豬瘟抗體阻斷ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX 公司。
1.4 試驗(yàn)動(dòng)物1.5~3.0 kg 健康易感(CSFV ELISA 抗體陰性)兔和健康易感斷奶仔豬(CSFV ELISA 抗體陰性,CSFV、豬圓環(huán)病毒2型和豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原陰性)均來自青島易邦生物工程有限公司;相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)均在該公司動(dòng)物中心進(jìn)行。
1.5 重組CSFV E2蛋白的生產(chǎn)及純化將本實(shí)驗(yàn)室保存的HEK-293T-E2細(xì)胞系擴(kuò)增至15 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,經(jīng)胰蛋白酶-EDTA 消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以1×107個(gè)/m L的密度傳代至15 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)長(zhǎng)成良好單層時(shí),棄去原培養(yǎng)液,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,以4 000 r/min離心5 min,收集細(xì)胞上清液,利用His Trap HP 柱層析方法純化蛋白;SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白的純度;BCA 方法測(cè)定純化后蛋白質(zhì)量濃度。
1.6 E2蛋白免疫原性的鑒定
1.6.1 對(duì)兔的免疫原性 將純化后的E2蛋白液用生理鹽水稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L,加入等量201 VG 佐劑,制備疫苗。選體溫穩(wěn)定的健康易感兔10只,隨機(jī)分為2組,每組5只。第1組為免疫組,各皮下注射第1 代HEK-293T-E2 細(xì)胞表達(dá)的E2蛋白液所制備的疫苗0.1 m L,第2組不免疫作為對(duì)照組。免疫后21 d采血,檢測(cè)CSFV ELISA抗體。
1.6.2 對(duì)豬的免疫原性 將純化后的E2蛋白液用生理鹽水稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L,加入等量201 VG 佐劑,制備疫苗。用健康易感(豬瘟抗原、ELISA 抗體均為陰性)豬10頭,隨機(jī)分為2組,每組5頭。第1組為免疫組,各頸部肌肉注射疫苗1.0 m L,一免后21 d用相同的疫苗,同等劑量進(jìn)行二免,第2組以免疫PBS作為對(duì)照組。二免后14 d,采血,檢測(cè)CSFV ELISA 抗體,然后所有豬頸部肌肉注射CSFV 石門系血毒1.0 m L(含不少于105.0MLD),觀察16 d。觀察期內(nèi)如有死亡豬,立即剖檢,剩余試驗(yàn)豬試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(攻毒后16 d)全部剖檢,記錄試驗(yàn)結(jié)果。
2.1 重組CSFV E2蛋白的純度和濃度分析將純化后的E2蛋白經(jīng)SDS-PAGE 鑒定純度,結(jié)果如圖1所示;Image Lab 軟件分析表明E2 蛋白純度在91.8%左右;BCA 結(jié)果測(cè)得純化后蛋白質(zhì)量濃度為232.7 mg/L。
2.2 E2蛋白對(duì)兔的免疫原性結(jié)果免疫組共5只兔,免疫后21 d抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫組抗體均為陽性,阻斷率均高于60%,而對(duì)照組抗體均為陰性,阻斷率均在30%以下(表1)。
2.3 E2蛋白對(duì)豬的免疫原性結(jié)果免疫組5頭仔豬抗體均為陽性,阻斷率均高于80%以上,對(duì)照組抗體均為陰性,阻斷率均在30%以下(表2)。攻毒后所有試驗(yàn)豬連續(xù)觀察16 d,每日測(cè)定體溫2次,觀察采食、飲水、精神等有無局部或全身不良反應(yīng),結(jié)果顯示免疫組在觀察期內(nèi)無明顯的體溫變化,也沒有采食、飲水、精神等局部或全身不良反應(yīng),且全部健活;對(duì)照組攻毒后1 d就有3頭體溫明顯升高,且能觀察到飲食下降及腹瀉等不良反應(yīng),從攻毒后9 d開始有豬死亡,整個(gè)觀察期內(nèi)5頭對(duì)照豬均有明顯發(fā)熱反應(yīng),共死亡5頭(圖2)。
圖1 SDS-PAGE檢測(cè)E2蛋白純度 M.蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker;1.E2純化蛋白;2.空白對(duì)照
表1 E2蛋白對(duì)試驗(yàn)兔免疫原性檢測(cè)結(jié)果
表2 E2蛋白對(duì)試驗(yàn)豬免疫原性檢測(cè)結(jié)果
圖2 E2蛋白免疫試驗(yàn)豬體溫測(cè)定結(jié)果
E2蛋白作為CSFV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在機(jī)體抗CSFV 的免疫保護(hù)中起著重要作用。我國(guó)多年來致力于E2亞單位疫苗的研制,并取得了重要進(jìn)展[8]。進(jìn)一步提高E2抗原的免疫原性和安全性,是促進(jìn)E2亞單位疫苗發(fā)展的動(dòng)力[9]。本課題組在前期研究中成功建立了一種穩(wěn)定表達(dá)E2蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HEK-293T-E2,該細(xì)胞系能高效表達(dá)分泌性的重組E2 蛋白,為E2 亞單位疫苗研制打下了基礎(chǔ)。本研究進(jìn)一步在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證E2蛋白的免疫原性,將純化后的E2蛋白液用生理鹽水稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為50 mg/L,按質(zhì)量比1∶1比例加入SEPPIC ISA 201 VG 佐劑,制備疫苗。先用兔對(duì)其免疫原性進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果顯示免疫兔全部陽性反應(yīng),對(duì)照組兔均為陰性反應(yīng)。然后用10頭健康易感仔豬進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組5頭仔豬,一免后35 d(二免后14 d)抗體全部轉(zhuǎn)陽且阻斷率均高于80%,并在攻毒后,在觀察期內(nèi)無明顯的體溫變化,無死亡;對(duì)照組攻毒后1 d起就有3頭體溫明顯升高,整個(gè)觀察期內(nèi)5頭對(duì)照豬均有明顯發(fā)熱反應(yīng),共死亡5頭。以上結(jié)果表明我們構(gòu)建的HEK-293T-E2細(xì)胞系表達(dá)的CSFV E2蛋白具有較好的免疫原性,免疫豬后能有效抵抗強(qiáng)毒的侵襲。
本研究建立的HEK-293T-E2 細(xì)胞系,能夠穩(wěn)定表達(dá)分泌性重組E2蛋白,解決了真核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn),并簡(jiǎn)化了重組蛋白純化過程。利用該系統(tǒng)生產(chǎn)的E2亞單位疫苗能成功誘導(dǎo)仔豬只產(chǎn)生抗CSFV E2的特異性抗體,而傳統(tǒng)豬瘟疫苗免疫豬只后,體內(nèi)只可產(chǎn)針對(duì)E2蛋白和Erns蛋白的特異性抗體,因此本疫苗可作為標(biāo)記性疫苗,以通過檢測(cè)Erns抗體來區(qū)分疫苗免疫和野毒感染(DIVA),剔除種群內(nèi)帶毒豬只,最終達(dá)到凈化豬場(chǎng)消滅豬瘟,且無明顯毒性反應(yīng)。本研究具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值,為后續(xù)E2亞單位疫苗的推廣應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。