張 森,石遠(yuǎn)菊,湯德元,王 彬,郭倩妤,廖少山,楊志剛 (貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽550025)

由于現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化程度不斷提高,豬群發(fā)生多種病原混合感染和繼發(fā)感染的情況也越來越多[1],豬呼吸與繁殖障礙類病毒性疫病混合感染是影響?zhàn)B豬生產(chǎn)實際中較為普遍的問題。常見的豬呼吸與繁殖障礙類病毒性疫病主要有:豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome disease,PRRS),豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus disease,PCVD),豬細(xì)小病毒病(porcine parvovirus disease,PPVD),豬偽狂犬病(pseudorabies virus disease,PR),豬流感(swine influenza,SI),豬日本乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)和豬瘟(classical swine fever,CSF)[2-6]。其中CSFV、PPV、PRV 和JEV 可導(dǎo)致豬繁殖障礙類疾病,SIV 主要導(dǎo)致呼吸道系統(tǒng)疾病,懷孕的母豬在感染SIV 時可引起繁殖障礙[7-8],而PRRSV 和PCV2不僅可以引起呼吸道疾病,而且還可引起繁殖障礙類疾病。除此之外,這7個病毒均可以不同程度地?fù)p害機(jī)體的免疫系統(tǒng),降低機(jī)體對外界的抵抗能力,引起繼發(fā)性混合感染,導(dǎo)致疫病復(fù)雜化,病癥更加嚴(yán)重[9]。因為這些疾病的臨床表現(xiàn)是相似的,常規(guī)診斷方法,如病毒分離和血清學(xué)診斷方法具有時間長和低靈敏度等缺陷,這不能滿足現(xiàn)實的臨床診斷需求。自1983年MULLIS等[10]首次建立PCR 技術(shù)以來,這種方法發(fā)展迅速,目前已成為動物疾病的診斷最有價值的方法,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)及其相關(guān)的領(lǐng)域,大大提高了疾病的檢測水平。多重PCR 檢測技術(shù)是在普通PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,多重PCR 可以同時添加多對引物和模板,在1個PCR 反應(yīng)管中同時擴(kuò)增出多個目的片段,具有節(jié)省時間、人力和物力的優(yōu)點,可以快速準(zhǔn)確地診斷疾病,適用于大量臨床樣本(特別是混合感染樣品)中病原體的快速診斷。針對不同動物病原體所建立的多重PCR 方法正在不斷增加,本研究擬建立一種能夠同時并同步檢測PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 這7種病原體單一和混合感染的多重PCR 檢測方法,以期對臨床病料進(jìn)行早期、快速、準(zhǔn)確的診斷,為豬病的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株、細(xì)胞及病料來源PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、JEV、PEDV、E.coli、APP 系貴州省動物疫病研究室分離鑒定并保存,SIV 由曾智勇教授惠贈;150份病料來源于2017 至2019 年貴州省9個不同地區(qū)(安順、赫章、福泉、長順、遵義、榕江、凱里、畢節(jié)、清鎮(zhèn))疑似呼吸和繁殖障礙癥狀的發(fā)病豬組織病料(肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié))及血樣。

1.2 主要試劑及儀器相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000 DNA Marker,Mini BEST Universal Genomic DNA &RNA Extraction Kit Ver.4.0,M-MLV 酶、dNTP、Oligo Primer、RNA酶抑制劑、p MD19-T Vector、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,均購自大連寶生物工程有限公司;1×T3 Super PCR Mix、金牌Mix(green)購自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司;E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒為OMEGA 公司產(chǎn)品;Icycler Thermal cycle型PCR 儀為BIO-RAD 公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計參照NCBI中PRRSV ORF6、SIV M、JEV NS1、CSFV E2、PRV gB、PCV2 ORF2、PPV NS1等基因的基因序列,運用多重PCR 引物設(shè)計系統(tǒng)MPprimer和多因素引物特異性評估系統(tǒng)MFEprimer設(shè)計多重PCR 引物,用于擴(kuò)增目的基因片段,引物序列詳見表1。

表1 擴(kuò)增目的片段的引物

1.4 病毒核酸的提取及cDNA 模板的制備分別將接毒后的細(xì)胞懸液及相關(guān)病毒的陽性病料反復(fù)凍融3次后,各取200μL,參照RNA&DNA 提取試劑盒說明書,按步驟提取病毒的核酸(RNA 和DNA),利用NanoDrop 2000 超微量紫外可見分光光度計測定其濃度,制備CSFV、JEV、PRRSV、SIV 的cDNA 模板,RT 反應(yīng)體系20.0μL:RNA 10.0μL,5×RT M-MLV Buffer 4.0 μL,10.0 μmol/L Oligo primer 2.5μL,10.0 mmol/L d NTP 2.0μL,RNase Inhibitor 0.5μL,M-MLV 1 μL。RT 反 應(yīng) 條 件:42℃1 h;72℃5 min。細(xì)菌DNA 的提取用熱煮沸法進(jìn)行,提取的DNA 及合成的c DNA 模板置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單一PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化及鑒定單一病毒的PCR 反 應(yīng) 體 系 為25.0 μL,金 牌Mix(green)21.0μL,上、下游引物各1.0μL,DNA 或c DNA 模板各2.0μL,PCR 反應(yīng)條件為95℃5 min;95℃45 s;退火溫度(50～60℃)45 s;72℃45 s,共進(jìn)行35個循環(huán);72℃10 min。選擇最佳的退火溫度,分別對7個病毒的核酸進(jìn)行10倍系列稀釋,以各個稀釋度的核酸為模板進(jìn)行單重PCR 敏感性試驗,取5.0μL PCR 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳測定。將上述7種病毒的PCR 擴(kuò)增片段膠回收后與p MD19-T 載體于16℃中連接12 h,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后均勻涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約12 h,挑取單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,送陽性質(zhì)粒的菌液至昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 七重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化對七重PCR 反應(yīng)條件,包括七重PCR 緩沖液及酶的選擇:1×T3 Super PCR Mix、金牌Mix(green)、10×LA PCR Buffer、2×GC Buffer、2×1 step Buffer、LA 酶、r Taq酶;對七重PCR 反應(yīng)體系、退火溫度、模板及引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)條件。

1.7 七重PCR 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗通過建立的七重PCR 方法分別以PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV、JEV、PEDV、APP、

E.coli及正常組織的DNA/c DNA 模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測該方法是否具有特異性;用滅菌三蒸水對7個病毒的核酸進(jìn)行10倍系列稀釋,然后取每個稀釋度的核酸為模板分別運用七重PCR 方法檢測其敏感性;選取7種病毒最佳濃度的DNA/cDNA 混合核酸作為模板以及最佳的反應(yīng)體系及條件,進(jìn)行七重PCR 重復(fù)性試驗。

1.8 七重PCR對臨床病料的檢測利用已建立的七重PCR 方法對2017－2018年收集于貴州省內(nèi)的共150份臨床病料進(jìn)行檢測,病死豬組織和血液的混合疾病材料重復(fù)冷凍和解凍3次,充分研磨,取勻漿液于離心機(jī)中12 000 r/min 離心5 min,各取200μL上清,參照DNA&RNA 提取試劑盒說明書上的步驟提取病毒核酸(DNA 和RNA),再反轉(zhuǎn)錄成c DNA,用建立的七重PCR 方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化及鑒定對7個病毒的單一PCR 反應(yīng)條件中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示:退火溫度在50～60℃間均可擴(kuò)增出目的條帶(圖1),將PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV 的單一PCR 產(chǎn)物膠回收后連接p MD19-T載體后,轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞,送昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果分析表明,擴(kuò)增片段分別為各自病毒的特異性基因片段。對7 個病毒的單重PCR 體系進(jìn)行敏感性試驗,單重PCR 中各病毒的最佳檢測量分別為PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 24 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg、CSFV 14 pg(圖2)。

圖1 PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 單 一PCR 退火溫度的優(yōu)化 M.DL2000 DNA Marker;1.60℃;2.58℃;3.56℃;4.54℃;5.52℃;6.陰性對照

圖2 PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 單 一PCR 敏感性試驗 M.DL2000 DNA Marker;1.10－1;2.10－2;3.10－3;4.10－4;5.10－5;6.10－6;7.10－7;8.10－8;9.陰性對照

圖3 多重PCR 緩沖液(Buffer)及酶的選擇 M.DL2000 DNA Marker;1.1×T3 Super PCR Mix;2.金牌Mix(green);3.10×LA PCR Buffer;4.2×GC Buffer;5.2×1 step Buffer;6.陰性對照

圖4 PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 七 重PCR 退火溫度的優(yōu)化 M.DL2000 DNA Marker;1.50℃;2.52℃;3.54℃;4.56℃;5.58℃;6.60℃

2.2 七重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化金牌Mix(green)和2×GC Buffer及r Taq酶均可同時擴(kuò)增出7種病毒的特異性條帶(圖3);選取金牌Mix(green)進(jìn)行多重PCR 體系及條件的優(yōu)化,七重PCR 最佳反應(yīng)體系為50μL:金牌Mix(green)30μL,上、下游引物濃度 均 為10 μmo L/L,引 物 量PRRSV、PCV2、PPV、SIV 各0.5μL,PRV、JEV、CSFV 各1.0μL,DNA/cDNA 模 板PRRSV、PCV2、PPV、SIV、JEV各1.0μL,PRV、CSFV 各1.5μL,退火溫度為54℃時,七重PCR 電泳效果最好(圖4),最佳反應(yīng)條件為:95℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45 s,共進(jìn)行35個循環(huán);72℃延伸10 min。2.3 七重PCR 特異性、敏感性及重復(fù)性試驗用已確定的七重PCR 反應(yīng)條件及體系進(jìn)行特異性試驗,結(jié)果表明:PEDV、APP、E.coli、正常組織模板均未擴(kuò)增出條帶,而PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 模板均擴(kuò)增出與目的片段大小相符的特異性條帶(圖5);對PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 這7個病毒的核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋,在建立的七重PCR 檢測方法反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增,敏感性結(jié)果顯示:各種病毒的最低檢測量分別為PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV17 pg、CSFV 14 pg(圖6);重復(fù)性試驗結(jié)果表明:6 次重復(fù)試驗均能擴(kuò)增出均勻一致的目的條帶,具有良好的重復(fù)性(圖7)。

2.4 七重PCR 對臨床病料的檢測150份病料檢測結(jié)果顯示(表2):PCV2與其他豬呼吸和繁殖障礙類病毒混合感染的情況較為嚴(yán)重,尤其與PRRSV混合感染的陽性率較高,150份臨床病料中二重混合感染陽性率高達(dá)66.00%(99/150);三重混合感染陽性率達(dá)11.33%(17/150);四重混合感染陽性率達(dá)2.00%(3/150);五重感染陽性率達(dá)0.67%(1/150);六重感染陽性率為0,七重感染陽性率為0,部分臨床病料檢測結(jié)果見圖8。

圖5 RRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 七重PCR 的 特 異 性 試 驗 M.DL2000 DNA Marker;1.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV PCR產(chǎn)物;2～12.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV、CSFV、PEDV、APP、正常組織、E.coli PCR 產(chǎn)物

圖6 PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV 和CSFV 七 重PCR 的 敏 感 性 試 驗 M.DL2000 DNA Marker;1.10－1;2.10－2;3.10－3;4.10－4;5.10－5;6.10－6;7.陰 性對照

圖7 七重PCR 重復(fù)性試驗 M.DL2000 DNA Marker;1～6.相同條件下的6次重復(fù)試驗

圖8 多重PCR 對貴州9個不同地區(qū)的部分臨床病料的檢測 M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL1000 DNA Marker;2～21.部分臨床病料;22.陰性對照;1,23.陽性對照

表2 貴州省部分地區(qū)2017－2019年150份臨床病料混合感染情況

3 討論

豬偽狂犬病毒(PRV),豬圓環(huán)病毒(PCV2),豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),豬瘟病毒(CSFV),豬細(xì)小病毒(PPV),豬流感病毒(SIV),豬日本乙型腦炎病毒(JEV)是豬病毒性呼吸道疾病和生殖障礙的常見病原體,這些豬呼吸道和生殖障礙類疫病廣泛存在于豬群中,給養(yǎng)豬業(yè)造成顯著的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,豬傳染性疾病多以病原的多重感染或混合感染為主要流行形式,夏道倫[11]發(fā)現(xiàn)70.00%以上的病豬以病毒病為主并且80.00%以上的病豬均是由2種或2種以上的病原體混合感染,導(dǎo)致病豬臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜化。這些病毒在感染后通常具有相似的臨床癥狀和病理變化,這很難直觀地診斷。多重PCR 方法可以在同一反應(yīng)系統(tǒng)中同時檢測多種病毒,并可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行臨床疾病診斷,具有很大的應(yīng)用前景。相對于常規(guī)PCR,多重PCR 方法的建立是復(fù)雜和困難的,引物設(shè)計和條件優(yōu)化是建立多重PCR 方法的重要關(guān)鍵步驟,多重PCR 包含多對引物,本研究中PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV、CSFV 各引物擴(kuò)增目的片段大小分別為:224,353,474,549,684,831,1 137 bp,本研究中各擴(kuò)增片段長度都相差在70 bp以上,靶片段具有足夠的大小差異可以提高瓊脂糖凝膠電泳上的分辨率。在該研究中,每個引物對的GC 含量和退火溫度Tm 值是相似的,這確保了靶片段可以在相同的退火溫度下有效地擴(kuò)增;通過增加擴(kuò)增效率低的基因引物量和減少擴(kuò)增效率高的基因引物量的方法來優(yōu)化引物的量;再通過增加大片段的模板,減少小片段的模板量來優(yōu)化模板濃度;用隨機(jī)引物擴(kuò)增RNA病毒,使其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR 反應(yīng)溶液使用金牌Mix(green)混合液,減少了繁瑣的加樣步驟和污染的可能性,進(jìn)一步確保了多重PCR 的及時性和準(zhǔn)確性;同時,通過6 次重復(fù)試驗驗證了建立的多重PCR 方法,結(jié)果一致。本研究在優(yōu)化和建立單一病毒PCR 檢測方法的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了酶的反應(yīng)條件,退火溫度,引物和模板濃度,確定了最佳的多重PCR 反應(yīng)條件,通過特異性、敏感性、重復(fù)性的測定,建立了能同時檢測DNA 和RNA 病毒的七重PCR 方法,該方法具有特異性強、敏感性高,容易操作等特點,完全可以滿足臨床檢測的要求,適用于豬群疫病流行病學(xué)調(diào)查和多種病原混合感染的快速診斷。

通過對2017－2019年采集的150份臨床病料進(jìn)行檢測,比較多重PCR 與單一PCR 的檢測情況,結(jié)果表明,陽性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV 的符合率均為100.00%,陽性CSFV 和PRV 的多重PCR 和單一PCR 檢測結(jié)果符合率為90.00%以上,多重PCR 未檢測出CSFV 或PRV 的部分病料,再通過單一PCR 復(fù)檢可以檢測出來,這可能與多重PCR 敏感度有一定的關(guān)系,單一PCR 技術(shù)比多重PCR技術(shù)敏感,與王隆柏等[12]報道的基本一致。顧文源等[13]研究結(jié)果表明,在河北省表現(xiàn)繁殖障礙疫病的豬群中,PRRSV 和CSFV 的感染較為普遍。

而在本研究中:PCV2與其他豬呼吸和繁殖障礙類病毒混合感染的情況較為嚴(yán)重,尤其與PRRSV混合感染的陽性率較高,研究結(jié)果表明PCV2 和PRRSV 將是貴州省未來豬病監(jiān)測及防治的重點。