師乾凱,張?jiān)鲑t,賈敬亮,張 迪,管 朔,侯林杉,范京惠?,左玉柱? (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,

河北 保定071001;2.河北省寧晉縣畜牧獸醫(yī)管理辦公室,河北 寧晉055550;3.河北省衡水市畜牧技術(shù)推廣站,河北衡水053000)

豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus3,PCV3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種能夠引起仔豬消瘦、腹瀉、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸系統(tǒng)疾病及母豬繁殖障礙疾病的病毒[1-2]。該病毒于2016 年由PALINSKI等[2]在患豬皮炎腎病綜合征(PDNS)及繁殖障礙的豬中首次檢出,隨后在包括歐洲、亞洲、北美洲及南美洲等國(guó)家均有關(guān)于該病的報(bào)道[2-5]。我國(guó)于2016年由KU等[6]首次檢測(cè)到并報(bào)道了PCV3 的存在。然而,SUN 等[7]在對(duì)PCV3的回顧性研究中發(fā)現(xiàn),在中國(guó)PCV3的首次出現(xiàn)可追溯到1996年,表明多年來該病毒在國(guó)內(nèi)豬群中的長(zhǎng)期存在。自PCV3被發(fā)現(xiàn)以來,該病毒在發(fā)病豬群中一直有較高的陽(yáng)性率,并且,最近有研究調(diào)查指出PCV3在無(wú)臨床癥狀的豬群中同樣有較高的陽(yáng)性率,潛在危害豬群健康[8]。因此,進(jìn)一步了解PCV3在豬群中的發(fā)病情況、流行特點(diǎn)對(duì)該病的有效防控及降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

PCV3屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬,是繼豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)之后新出現(xiàn)的病原體。該病毒無(wú)囊膜,為單股環(huán)狀DNA病毒,其基因組大小為2 000 bp,由2個(gè)主要的開放性閱讀框(ORF1和ORF2)組成[2]。其中ORF1主要編碼一種參與病毒復(fù)制的相關(guān)蛋白(replicationassociated protein,Rep),該蛋白相對(duì)保守;ORF2主要編碼該病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白(capsid protein,Cap),被認(rèn)為與病毒的感染及免疫相關(guān)。作為除PCV2又新出現(xiàn)的1種圓環(huán)病毒科,PCV3的研究尚未深入。同PCV2類似,目前,關(guān)于PCV3的研究主要集中在該病毒的ORF2區(qū)域,一些診斷方法的建立及病毒的功能性研究也主要依賴于Cap蛋白進(jìn)行展開[9],同樣,國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要依據(jù)PCV3的Cap蛋白對(duì)病毒進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建及遺傳變異分析,為病毒的遺傳演化及生物特性研究提供理論基礎(chǔ)[10]。

本研究中,為了解河北省PCV3的流行情況及遺傳變異特征,對(duì)2017年2月至2018年7月間采集自本省的310份病料進(jìn)行PCV3的檢測(cè),同時(shí)對(duì)該病毒的cap基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并構(gòu)建進(jìn)化樹,為PCV3的綜合防控及進(jìn)一步研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集2017年2月至2018年7月間,從河北省不同地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)采集310份臨床表現(xiàn)為腹瀉、呼吸系統(tǒng)疾病、皮炎、繁殖障礙等癥狀的不同年齡段發(fā)病豬的組織臟器,于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑DNA/RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒、普通質(zhì)粒小量提取試劑盒和TaqPlus Master Mix 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、p MD19-T 載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、PCV2、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)診斷試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank已登錄的PCV3的基因序列,利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5在PCV3的基因和cap基因分別設(shè)計(jì)1對(duì)檢測(cè)引物和1對(duì)用于擴(kuò)增cap基因全長(zhǎng)的引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 組織樣品處理及病毒核酸提取取組織病料及無(wú)菌PBS水,按照1∶5比例混合、研磨成組織勻漿,經(jīng)反復(fù)凍融3次;7 000 r/min離心10 min,取其上清進(jìn)行核酸提取。按照DNA/RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒核酸的提取,同時(shí)取部分核酸樣品按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備c DNA,置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.5 組織樣品的PCR 檢測(cè)以提取的樣品核酸DNA 作為模板,使用引物PCV3-F/PCV3-R 進(jìn)行檢測(cè),PCR 反應(yīng)體系20μL:2×TaqPlus Master Mix 10μL,DNA 模 板2 μL,上、下 游 引 物 各1 μL(20μmo L/L),dd H2O 6μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃30 s,54℃30 s,共35 個(gè)循環(huán);72℃7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,純化后分別克隆至p MD19-T 載體,陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的組織樣品,以其核酸DNA/RNA 作為模板,分別使用PRRSV、PRV、PPV、PCV2、PEDV 診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè),調(diào)查PCV3與其他病毒的共感染情況。

1.6 PCV3 cap 基因組擴(kuò)增及序列比對(duì)分析從鑒定為PCV3陽(yáng)性的組織病料中隨機(jī)挑選不同地區(qū)的樣品DNA 作為模板,使用引物PCV3-capF/PCV3-capR 進(jìn)行cap基因序列擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。利用DNA Star軟件中的Meg Align軟件對(duì)測(cè)序成功的cap基因與GenBank中已發(fā)表的參考基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),分析河北省不同地區(qū)毒株之間的變異情況;同時(shí),使用MEGA 7軟件對(duì)獲得的cap基因序列與參考序列進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建,了解毒株的遺傳進(jìn)化情況。

2 結(jié)果

2.1 PCV3 的 流 行 病 學(xué) 調(diào) 查對(duì)2017 年2 月 至2018年7月間,從河北省不同地區(qū)60個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的310份病料進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示PCV3的樣品陽(yáng)性率為16.5%(51/310),豬場(chǎng)陽(yáng)性率為45.0%(27/60)。對(duì)不同市的檢測(cè)結(jié)果分析顯示滄州地區(qū)的檢出率明顯高于其他地市,可達(dá)29.1%(圖1);對(duì)患有不同臨床癥狀的發(fā)病豬進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明在患有腹瀉及繁殖障礙的豬中具有高的陽(yáng)性率,分別可達(dá)23.6%(13/55)和23.5%(8/34)(表2)。同時(shí),在本研究中對(duì)PCV3與其他病毒的共感染情況進(jìn)行了調(diào)查分析,結(jié)果顯示以PCV3 與PCV2共感染情況最為多見為33.3%(17/51),其次為PRRSV(15.7%),PEDV(13.7%),PRV(11.8%)和PPV(3.9%)。

圖1 河北省不同地區(qū)PCV3病原調(diào)查結(jié)果

表2 不同臨床癥狀PCV3感染結(jié)果

2.2 PCV3 cap 基因序列擴(kuò)增結(jié)果本研究選取了河北省部分地區(qū)的8份PCV3陽(yáng)性病料,并對(duì)cap基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示所得cap基因序列大小為645 bp,并上傳至GenBank(表3)。

2.3 PCV3 cap 基因序列分析Cap蛋白被認(rèn)為與圓環(huán)病毒的毒力有關(guān),并且被廣泛用于該病毒的分型及活性研究[11-12]。本研究用DNAStar軟件對(duì)8株P(guān)CV3病毒的cap基因進(jìn)行序列比對(duì)顯示,所得序列之間的核苷酸相似性為98.0%～99.7%,所推導(dǎo)的氨基酸相似性為97.7%～99.5%。其中,PCV3/CH/HB-ZJK/2018 株 與PCV3/CH/HB-TS/2018 株,PCV3/CH/HB/BD/2017 株 與 PCV3/CH/HB/CZ-1/2017株核苷酸差異性最小為99.7%;PCV3/CH/HB/CZ-2/2017株與PCV3/CH/HB/SJZ/2017 株之間核苷酸差異性最大為98.0%。8株P(guān)CV3病毒的cap基因與GenBank所登錄的24條國(guó)內(nèi)外參考株之間序列比對(duì),結(jié)果顯示基因序列間的核苷酸相似性為98.0%～100.0%,所推導(dǎo)的氨基酸相似性為97.2%～99.5%。其中,PCV3/CH/HB-ZJK/2018株與中國(guó)株P(guān)CV3/CN/Fujian-HWK2/2016株之間的核苷酸差異性最小為100.0%;PCV3/CH/HB/HD/2017株與美國(guó)株P(guān)CV3/2164/USA 株之間的核苷酸差異性最大為98.0%(圖2)。

表3 PCV3分離株登錄號(hào)及來源

圖2 PCV3 cap 基因核苷酸序列比較

對(duì)cap基因所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示所推導(dǎo)的Cap蛋白氨基酸共215個(gè),無(wú)氨基酸插入或缺失等現(xiàn)象發(fā)生。與24條國(guó)內(nèi)外參考株進(jìn)行比對(duì)結(jié)果顯示,Cap蛋白上的氨基酸突變主要發(fā)生在24,27,77及150處氨基酸位點(diǎn)(圖3)。其中,在24～27處氨基酸位點(diǎn)有4種突變,顯示分別為24VRRR27、24ARRR27、24ARRK27和24VRRK27,本研究所獲得的8條Cap氨基酸序列中,有5條(PCV3/CH/HB/BD/2017 株、PCV3/CH/HB/CZ-1/2017 株、PCV3/CH/HB-ZJK/2018株、PCV3/CH/HB/HD/2017株和PCV3/CH/HB/SJZ/2017 株)為24ARRK27突變,有2 條(PCV3/CH/HB/CZ-2/2017 株 和PCV3/CH/HB-CD/2018株)為24ARRR27突變,有1條(PCV3/CH/HB-TS/2018株)為24VRRR27突變。在77和150處氨基酸位點(diǎn)變異主要為77 S→T,150 I→L,這2處突變主要發(fā)生在24ARRR27變異組中,參考序列中77和150位氨基酸突變都是同時(shí)發(fā)生,但在本研究中分離的PCV3/CH/HB/CZ-2/2017株只在150處氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變。另外,PCV3/CH/HB/CZ-1/2017株在156氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了156 S→R突變,PCV3/CH/HB/SJZ/2017株在180氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了180V→A突變。這些位點(diǎn)的突變可能會(huì)改變病毒的致病性及毒力。

圖3 PCV3 ORF2氨基酸序列比較

應(yīng)用生物學(xué)軟件MEGA7.0對(duì)研究所獲得的8條cap基因序列及24條參考序列進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建,遺傳變異情況分析顯示所分析的31條分離株可分為3個(gè)基因群3a,3b和3c(圖4)。與圖3結(jié)果對(duì)比分析顯示,基因群3a主要包括24ARRR27突變株及1條24VRRR27突變株(PCV/KU-1601 株),基因群3b主要包括24ARRK27突變株,基因群3c主要包括24VRRK27突 變 株 及1 條24VRRR27突 變 株(PCV3/CH/HB-TS/2018株),本研究中所分離的8條分離株均在基因群3a和3c中,說明了河北省PCV3病毒序列相對(duì)穩(wěn)定。

圖4 PCV3 cap 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

PCV3自2016年被報(bào)道以來,已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒,PCV3致病性及許多生物學(xué)特性方面的研究尚處于探索階段,迄今為止尚未有關(guān)于成功分離PCV3的報(bào)道,且無(wú)有效疫苗用于該病的防控,因而,現(xiàn)階段對(duì)該病毒的研究熱點(diǎn)主要集中在流行病學(xué)調(diào)查及毒株的遺傳進(jìn)化分析方面[10]。目前,已有許多國(guó)家報(bào)道了該病的流行情況,發(fā)現(xiàn)其在發(fā)病豬群及健康豬群中均具有較高的陽(yáng)性率,為該病的流行情況及發(fā)病特點(diǎn)提供了理論參考。因此,進(jìn)一步了解PCV3在河北省的流行情況及毒株特點(diǎn)有助于為PCV3的綜合防控提供科學(xué)的指導(dǎo)。

本研究對(duì)2017年2月至2018年7月間,從河北省不同地區(qū)豬場(chǎng)采集的310份臨床樣本檢測(cè)顯示其陽(yáng)性率可達(dá)16.5%,該結(jié)果略高于WANG 等[13]2017年所報(bào)道的陽(yáng)性率,進(jìn)一步證實(shí)了該病毒在河北省的存在及流行。與臨近的省市相比,本研究的檢出率低于河南、北京及山東地區(qū)的陽(yáng)性率[8,14-15],說明較周邊地區(qū)相比,河北省PCV3的感染情況相對(duì)穩(wěn)定。PCV3感染豬后可引起呼吸系統(tǒng)疾病,關(guān)節(jié)腫脹、多系統(tǒng)綜合征及母豬繁殖障礙等臨床癥狀,在危害豬群健康的同時(shí)也給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,在我們的研究中,對(duì)表現(xiàn)為不同臨床癥狀的PCV3發(fā)病豬群進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)在臨床表現(xiàn)為腹瀉及繁殖障礙的發(fā)病豬中陽(yáng)性率較高,這一結(jié)果與ZHAI等[16]和FU 等[17]調(diào)查結(jié)果相似,表明了PCV3可作為1個(gè)病原在腸道感染及生殖系統(tǒng)感染中發(fā)揮重要作用,但其對(duì)機(jī)體中的致病機(jī)理還需進(jìn)一步研究。作為繼PCV2之后的又一新出現(xiàn)的圓環(huán)病毒科病毒,PCV3與其他病毒共同感染研究已被廣泛報(bào)道,其中最為常見的是可以與PCV2,PRRSV 和PRV 等病原體的共感染,在本研究中,我們對(duì)PCV3陽(yáng)性病料中臨床常見的幾種病毒進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PCV2與PCV3的共感染率可達(dá)33.3%,顯著高于與其他病毒的共感染情況,此結(jié)果與XU等[14]和FU 等[17]研究結(jié)果相似,表明PCV3 與PCV2在豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)中有重要的致病作用,并推測(cè)在感染過程中病原間的毒力可能有相互促進(jìn)作用。

在本研究中,對(duì)8 個(gè)河北省分離的病毒進(jìn)行cap基因的擴(kuò)增、序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建,結(jié)果顯示所獲得的8個(gè)分離株與國(guó)內(nèi)外參考株間的同源性可達(dá)98.0%～100.0%,表明同源性較高,國(guó)內(nèi)外PCV3流行株相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)其進(jìn)化樹的構(gòu)建及氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),所分析的32條cap基因序列可分為3a、3b和3c共3 個(gè)基因群,其中基因群3a主要包括24ARRR27突變株,基因群3b主要包括24ARRK27突變株,基因群3c主要包括24VRRK27突變株,進(jìn)一步證實(shí)了FU 等[17]學(xué)者的研究結(jié)果。SUN 等[7]在一次回顧性研究1993－2017年所分離的PCV3毒株的Cap氨基酸序列分析得到,PCV3在Cap位點(diǎn)上突變順序由24ARRR27至24ARRK27而后突變?yōu)?4VRRK27。然而,在我們的分析中,除上述3種突變外,還存在2條分離株序列發(fā)生了24VRRR27突變,這2條分離株在進(jìn)化樹上顯示分別位于3a和3c基因群中,我們的結(jié)果可為PCV3進(jìn)化動(dòng)力學(xué)的研究提供一個(gè)參考,該推測(cè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。另外,除24及27位氨基酸位點(diǎn)有主要變異外,其他位置變異的發(fā)生及突變后是否對(duì)毒株的毒性產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究說明。

本研究中對(duì)河北省規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)病豬的檢測(cè),證實(shí)了PCV3在該地區(qū)豬場(chǎng)的廣泛存在。在研究中也對(duì)該病毒的發(fā)病特點(diǎn)及流行情況進(jìn)行了調(diào)查,同時(shí),通過對(duì)分離株的遺傳變異分析我們得到了不同基因群的PCV3流行株,為該病毒在河北省的流行及進(jìn)化特點(diǎn)提供了理論參考。這些數(shù)據(jù)可為該地區(qū)PCV3的診斷及綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。