趙 宇,崔建濤,田潤博,韓昊瑩,鄭慧華,劉 芳,陳紅英,2? (.河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南

鄭州450002;2.鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室,河南 鄭州450002)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的一種重要傳染病[1]。PRV 屬于皰疹病毒科,α-皰疹病毒亞科,其基因組大小約為150 kb,可以編碼多種病毒蛋白的雙鏈DNA 病毒[2]。PRV 能夠感染各個年齡階段的豬只,仔豬感染后死亡率達到100%,育肥豬感染后生長緩慢,妊娠母豬感染后發(fā)生繁殖障礙,出現(xiàn)流產(chǎn),產(chǎn)死胎,木乃伊胎等現(xiàn)象,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

2016年,PALINSKI等[4]從患病母豬和流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。PCV3為單股環(huán)狀的DNA 病毒,屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬,PCV3主要包括2個開放閱讀框(ORF),Rep基因與病毒的復制相關,編碼297個氨基酸,Cap蛋白主要與病毒的致病性相關。PCV3與皮炎與腎病綜合征、呼吸道疾病以及繁殖障礙等疾病有關,在死胎和精液中可以檢測出PCV3[5-6],已引起國內(nèi)外獸醫(yī)工作者的廣泛關注。目前PCV3在美國[4]、中國[5]、巴西[6]、泰國[7]、韓國[8]、日本[9]以及歐洲等多個國家和地區(qū)流行[10-15]。

PRV 與PCV3的混合感染在我國豬場已經(jīng)存在[16],且PRV 和PCV3 均可引起母豬繁殖障礙[3-5],在臨床診斷上難以區(qū)分這2種病原體引起的感染,因此需要建立實驗室的診斷方法。目前,PRV 的檢測方法有病毒分離、ELISA、普通PCR 和qPCR 等檢測技術,PCV3的檢測方法有普通PCR、qPCR 和ELISA 等,然而迄今尚未有建立能夠同時檢測和區(qū)別PRV 和PCV3的檢測方法。因此,本試驗建立的能夠同時檢測PRV 和PCV3的雙重PCR檢測方法,為我國PRV 和PCV3的防控和檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株、臨床樣品通過PCR 方法對鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室保存的病料進行PCV3擴增并測序,將鑒定為陽性的病料作為PCV3陽性對照。PRV 強毒株(PRV HN2012)由鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室從患有神經(jīng)癥狀的仔豬中分離并保存。PCV2、豬細小病毒(PPV)、豬藍耳病病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)均由鄭州市豬重大疫病防控重點實驗室保存。

2017－2018 年,39 份病料樣品(包括腦,淋巴結(jié),小腸,肺臟和脾臟)采自山西省文水,河南省孟州、新密以及許昌等10個地市14個養(yǎng)殖場患有繁殖障礙疾病的39頭豬。取適量的樣品,制成組織勻漿,經(jīng)－80℃反復凍融3 次后,12 000 r/min 離心5 min。取上清液,于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑TRIzol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司;病毒DNA 快速純化試劑盒和凝膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;2×TaqMaster Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司;p MD18?-T 載體、X-gal、IPTG、瓊脂糖等均購自寶生物工程(大連)有限公司;其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 引物設計參考GenBank 中登錄的PRV(KF042383、KF017615、KF130880)g E基 因 和PCV3的全基因組序列(KX778720、KX966193),利用引物軟件Primer 5.0,設計了2對特異性引物,預期擴增片段長度分別為PRV 的429 bp和PCV3的344 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成(表1)。

表1 雙重PCR 引物序列

1.4 核酸的提取按照病毒DNA 快速純化試劑盒說明書,分別進行PRV、PCV3、PCV2、PPV DNA的提取,并于－80℃保存;根據(jù)TRIzol說明書提取PEDV、PRRSV 和CSFV 總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,并于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PRV和PCV3陽性標準樣品的制備利用引物P1和P2 分 別 進 行PRV 和PCV3 單 項PCR 擴增。反應體系為:2×TaqMaster Mix 10 μL,dd H2O 8μL,上、下游引物各為0.5μL,模板量為1.0μL。反應程序為95℃5 min;95℃30 s、56℃25 s,72℃30 s,共35 個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。用DNA 凝膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物,純化后連接至p MD18-T 載體、構(gòu)建重組質(zhì)粒p MD18-PRV 和p MD18-PCV3。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行序列測定,且與GenBank中選取的參考序列進行同源性比對,以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。利用紫外分光光度計檢測2種陽性質(zhì)粒濃度并分別計算拷貝數(shù)。

1.6 PRV和PCV3雙重PCR的建立

1.6.1 雙重PCR 方法最佳條件 通過對退火溫度(52～62℃)、引物比例進行優(yōu)化,最終確定雙重PCR 的最佳反應條件。

1.6.2 雙重PCR 的特異性試驗 以PRV、PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、CSFV 的DNA 或cDNA 為模板,同時設立陰性對照,根據(jù)已優(yōu)化好的雙重PCR 條件進行擴增,以檢測該方法的特異性。

1.6.3 雙重PCR 的靈敏度試驗 將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒p MD18-PRV 和p MD18-PCV3等體積混合后進行10倍倍比稀釋,并將各個稀釋度的標準質(zhì)粒作為模板通過已優(yōu)化條件的雙重PCR 方法進行擴增,檢測該方法的靈敏度。

1.7 雙重PCR的重復性試驗通過已優(yōu)化條件的雙重PCR 方法對采自不同地區(qū)含PRV 和PCV3的3份陽性病料樣品DNA 進行雙重PCR 檢測,并做3次重復。

1.8 臨床樣品的檢測利用雙重PCR 方法對采自山西省文水,河南省孟州、新密以及許昌等10個地市14 個養(yǎng)殖場的39 份病料進行檢測,并與單項PCR 檢測方法進行比較。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR 擴增結(jié)果用臨床組織樣品DNA作為模板,利用引物P1和P2 分別進行PCR 擴增PRV 和PCV3,擴增大小分別為429和344 bp(圖1),與預期相符。將PCR 產(chǎn)物純化回收后,連接到載體p MD18-T 中進行測序,測序結(jié)果表明,所克隆的PRV 目的片段大小為429 bp,與GenBank中的PRV 參考株核苷酸序列同源性為100%;所克隆的PCV3目的片段大小為344 bp,與GenBank 中的PCV3參考株核苷酸序列同源性為100%,表明PCR 產(chǎn)物為PRV 和PCV3的目的片段。通過紫外分光光度計分別檢測PRV 和PCV3的濃度,經(jīng)計算PRV 的拷貝數(shù)為5.02×1010copies/μL,PCV3的拷貝數(shù)為9.12×1010copies/μL。

圖1 PRV 和PCV3目的基因PCR 擴增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.PRV 的PCR 產(chǎn) 物;2.PCV3 的PCR產(chǎn)物;3.PRV 的陰性對照;4.PCV3的陰性對照

2.2 雙重PCR擴增結(jié)果通過反應體系和擴增條件的優(yōu)化,最終確定雙重PCR 的反應體系為2×TaqMaster Mix 10 μL,dd H2O 6 μL,PRV 和PCV3上、下游引物均為0.5μL,PRV 和PCV3 的混合DNA 為2.0μL。雙重PCR 的反應程序為95℃5 min;95℃30 s、56℃25 s,72℃30 s,共35個循環(huán);72℃10 min(圖2)。

圖2 PRV 和PCV3雙重PCR 擴增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.PRV 和PCV3 雙 重PCR 產(chǎn) 物;2.PRV 和PCV3雙重擴增陰性對照

2.3 雙重PCR特異性結(jié)果通過已經(jīng)優(yōu)化條件的雙重PCR 對PRV、PCV3、PCV2、PRRSV、PEDV、PPV、CSFV 的DNA 或c DNA 進行PCR 擴增,并設立陰性對照。同時可以擴增出PRV 的429 bp片段和PCV3的344 bp片段,而其他病毒核酸以及陰性對照均無特異性條帶,表明該方法具有良好的特異性(圖3)。

圖3 雙重PCR 特異性檢測結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1.雙 重PCR 產(chǎn) 物;2.PCV2的PCR 產(chǎn) 物;3.PPV 的PCR 產(chǎn) 物;4.PEDV 的PCR 產(chǎn) 物;5.PRRSV DNA 模板的PCR 產(chǎn)物;6.CSFV DNA 模板的PCR 產(chǎn)物;7.陰性對照

2.4 雙重PCR 靈敏度結(jié)果將PRV 和PCV3的標準陽性質(zhì)粒等體積混合后進行10倍系列稀釋,選取101～1010的稀釋度進行雙重PCR 擴增,同時設立陰性對照。結(jié)果顯示,PRV 和PCV3的最低檢測值分別為:502.0 和91.2 copies/μL,表明該方法具有良好的靈敏性(圖4)。

圖4 雙重PCR 靈敏度結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～10.PRV 和PCV3混合模板作101～1010稀釋后的擴增結(jié)果;11.陰性對照

2.5 雙重PCR重復性試驗結(jié)果通過已優(yōu)化條件的雙重PCR 方法對采自不同地區(qū)含PRV 和PCV3的3份陽性病料樣品DNA 進行雙重PCR 檢測,并做3 次重復,每次PCR 擴增結(jié)果均為PRV 和PCV3陽性,表明該方法具有很好的可重復性。

2.6 臨床診斷結(jié)果通過建立的雙重PCR 和單重PCR 對采集的39 份臨床樣品進行PCR 擴增。擴增結(jié)果顯示,PRV 的陽性率為17.95% (7/39),PCV3的陽性率為33.33% (13/39),混合感染率為10.26% (4/39),且雙重PCR 與單重PCR 的結(jié)果相一致。

3 討論

g E基因作為偽狂犬病病毒毒力基因之一,在PRV 的神經(jīng)嗜性和毒力方面起到了重要的作用,但其編碼的糖蛋白非病毒復制所必需,病毒缺失g E基因后依然能復制,因此檢測g E基因來區(qū)分PRV野毒株感染和疫苗株感染[17]。自PCV3被發(fā)現(xiàn)以來,PCV3在世界范圍內(nèi)逐漸流行[4-15],并在我國多個省份多個豬場存在,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了潛在的威脅,有報道稱PCV3有可能與繁殖障礙相關[4-5]。由于PRV 與PCV3均可引起繁殖障礙,在臨床診斷上區(qū)分這2種病原體具有一定的難度,而雙重PCR技術不僅在單重PCR 技術基礎上能夠滿足對疾病混合感染的診斷,節(jié)約試驗成本,而且更符合對疾病快速診斷的要求。因此,本試驗針對PRV 的g E基因和PCV3 的Rep基因,建立能夠同時檢測PRV和PCV3 的雙重PCR 檢測方法,為檢測和防控PRV 和PCV3提供技術支持。

本試驗通過對雙重PCR 的條件進行優(yōu)化,最終建立最佳的雙重PCR 檢測方法。擴增結(jié)果顯示,可以擴增出大小分別為PRV 429 bp 和PCV3 344 bp的特異性片段,2種擴增產(chǎn)物大小相差約80 bp,因此,利用凝膠電泳能夠較好的、直觀的分辨這2種病原體。特異性試驗表明,除了PRV 和PCV3出現(xiàn)目的條帶以外,其他病原體均無條帶,表明該方法具有較高的特異性。靈敏度顯示,PRV 的最小檢測下線為502.0 copies/μL,與趙麗等[18]建立的PRV qPCR方法的靈敏度相當;PCV3 的最小檢測下線為91.2 copies/μL,與肖琦等[19]、徐朋麗等[20]所建立的普通PCR 方法以及郝占武等[21]建立的PCV3 qPCR 方法檢測下線相當,說明本試驗所建立的雙重PCR 檢測方法具有良好的靈敏度。

本試驗通過已經(jīng)建立的雙重PCR 檢測方法,對采自山西省文水,河南省孟州、新密以及許昌等10個地市14個養(yǎng)殖場的39份病料進行PCR 擴增,結(jié)果顯示PRV 的陽性樣品數(shù)為7 份,陽性率為17.95% (7/39),其中4份陽性樣品分布于河南省,3份陽性樣品分布于山西省,表明在河南以及山西地區(qū)的豬場仍然存在著PRV 野毒的感染;PCV3的陽性樣品數(shù)為13份,陽性率為33.33%(13/39),其中7份陽性病料分布于河南省,6份陽性病料分布于山西省,表明PCV3感染已經(jīng)在河南省和山西省存在,并且陽性率與徐朋麗等[20]檢測結(jié)果基本一致。PRV 和PCV3的混合感染樣品數(shù)為4份,陽性率為10.26% (4/39),其中2份陽性病料分布于河南省,另外2份分布于山西省,表明PRV 和PCV3的混合感染已經(jīng)出現(xiàn)在河南省以及山西省的豬場。

目前,雖然PCV3并未分離出來,但有研究報道PCV3與繁殖障礙有關,并且相關文獻報道PCV3與PRV 的混合感染是存在的,由于PRV 與PCV3均有可能引起繁殖障礙,在臨床診斷上難于區(qū)分這2種病原體。因此本試驗建立一種快速,高效,簡便的PRV 和PCV3 雙重PCR 檢測方法,為我國的PRV 和PCV3的防控和檢測提供技術支持。