郭振華,阮海宇,李 翔,張改平,? (.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州45000;.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州45000;.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南 昆明65000)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)是引起豬病毒性腹瀉的重要病原之一,特別是2010 以來,隨著PEDV 變異株的出現(xiàn),導(dǎo)致了豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhoea,PED)在我國(guó)的再度大范圍流行[1-2]。2013年,PED在美國(guó)的暴發(fā),標(biāo)志著PEDV 在世界范圍內(nèi)的再度流行[3-4]。糞口途徑是PEDV 傳播的主要途徑,雖然各個(gè)日齡的豬均可感染,但以新生仔豬的高發(fā)病率和高死亡率為主要特點(diǎn),臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉和嚴(yán)重的脫水;中大豬通常表現(xiàn)為一過性的水樣腹瀉[5]。

PEDV屬于尼多病毒目(Nidovirales),冠狀病毒科(Coronaviridae),甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)[6],同屬于該科的還有豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)以及2014年報(bào)道的豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDcoV)和2017－2018年報(bào)道的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)[3,7-10]。PEDV 為帶囊膜的單股正鏈RNA 病毒,基因組大小約28 000 bp,包含7個(gè)開發(fā)閱讀框(open reading frames,ORFs),分別編碼

ORF1a、ORF1b、spike(S)、ORF3、envelope(E)、membrane(M)、nucleoprotein(N)[11]。其中S蛋白是1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為200 000的糖蛋白,與病毒入侵宿主細(xì)胞緊密相關(guān),也是產(chǎn)生中和抗體的主要靶標(biāo)蛋白。S蛋白又可以被剪切為S1(1～730 aa)和S2(731～1 383 aa)2個(gè)亞基,S1亞基與受體的結(jié)合有關(guān),也是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體的主要區(qū)域;而S2亞基則與膜融合有關(guān)。S1亞基含有4個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域,分別為S10(19～211 aa)、S1A(212～511 aa)、S1B(512～641 aa)和S1CD(642～730 aa)。其中S10區(qū)是1個(gè)高度變異的區(qū)域,氨基酸的插入和缺失也主要發(fā)生在這一區(qū)域[12]。

監(jiān)測(cè)引起豬病毒性腹瀉的主要病原的流行情況和遺傳變異情況,有助于制定針對(duì)性的預(yù)防控制方案。本研究檢測(cè)了河南省94份臨床仔豬腹瀉的腸道或糞便樣品,開展了針對(duì)4種豬腸道冠狀病毒的分子檢測(cè)工作。同時(shí)我們針對(duì)成功獲得的8 株P(guān)EDV 的S1基因片段序列,通過遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建和氨基酸序列的比對(duì),分析了當(dāng)前流行毒株的主要分子遺傳和變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病料采集及預(yù)處理腹瀉病料主要來自2017年度河南省內(nèi)發(fā)生仔豬腹瀉的養(yǎng)殖場(chǎng),共收集了來自25個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的94份病料樣品。腸道或糞便樣品加入適量的PBS 緩沖液,勻漿后反復(fù)凍融3 次,12 000 r/min 離心2 min,將上清轉(zhuǎn)入新的1.5 m L離心管中,－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成本研究所用的引物序列信息參見表1。其中PEDV、TGEV、PDco V 和SeCo V 的檢測(cè)引物參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[3,8,13],擴(kuò)增PEDVS1基因片段的引物是根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的序列,利用Primer Premier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。所有的引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.3 核酸提取與RT-PCR病毒核酸提取試劑(Ta KaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反轉(zhuǎn)錄試劑(PrimeScript RT Master Mix)、DNA 聚 合 酶(TaqPlus Master Mix,Prime-STAR Max DNA Polymerase)均購自寶生物工程(大連)有限公司。具體的操作參照產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA 保存于－20℃。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25μL)如下:2×TaqPlus Master-Mix 或 者 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5μL,cDNA 模 板2.0 μL,上、下 游 引 物 各0.5μL,dd H2O 9.5μL。反應(yīng)參數(shù)如下:98℃預(yù)變性2 min;98℃變性10 s,55℃退火15 s或者30 s,72℃延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段大小進(jìn)行設(shè)定;共30 個(gè)循環(huán);最后延伸72℃5 min。PCR 產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.4 基因克隆與測(cè)序基因的克隆使用高保真DNA 聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒(E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit,Omega Bio-tek,Inc.)進(jìn)行切膠回收純化,獲得的基因片段直接連接到p EASY-blunt載體上(北京全式金生物技術(shù)有限公司),轉(zhuǎn)化Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司),利用菌落PCR 鑒定陽性克隆,分別挑取3個(gè)陽性克隆送生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 遺傳變異分析及進(jìn)化樹構(gòu)建序列的同源性分析主要使用 DNAStar Meg Align(Clustal W method)軟件進(jìn)行。序列的比對(duì)分析主要通過MEGA6.0(Clustal W method)來進(jìn)行;進(jìn)化樹的構(gòu)建主要基于MEGA6.0(Neighbor-joining method)來進(jìn)行。參考毒株序列信息主要從NCBI的Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中獲得,具體的序列信息見表2。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 臨床檢測(cè)結(jié)果發(fā)生仔豬腹瀉的25家養(yǎng)豬場(chǎng)分別位于河南省的12 個(gè)地市(表3),檢測(cè)結(jié)果顯示,19家養(yǎng)豬場(chǎng)PEDV 檢測(cè)為陽性,占發(fā)生腹瀉豬場(chǎng) 的76.0%;94 份 腹 瀉 病 料 中,64 份 為PEDV 陽性,約占檢測(cè)病料的68.1%。同時(shí),我們也檢測(cè)了其他3 種引起仔豬腹瀉的豬腸道冠狀病毒TGEV、PDco V 和SeCo V,結(jié)果均為陰性。說明當(dāng)前河南省內(nèi)引起仔豬病毒性腹瀉的病原主要是PEDV。

2.2 基于S 1基因的遺傳進(jìn)化樹分析本研究共獲得了8株流行性腹瀉病毒的S1基因片段序列,根據(jù)其養(yǎng)殖場(chǎng)所在的地市分別命名為HeNJZ/2017(焦 作)、HeNLY/2017(洛 陽)、HeNLH/2017(漯河)、HeNPDS/2017(平 頂 山)、HeNZK/2017(周口)、HeNZM/2017(中牟)、HeNWX/2017(溫縣)和HeNYZ/2017(禹州)。結(jié)合從NCBI GenBank數(shù)據(jù)中選取的36株參考序列,利用MEGA6.0軟件繪制了河南省流行毒株的遺傳進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示,我國(guó)的PEDV 可以分為2個(gè)大的進(jìn)化分支:G1經(jīng)典毒株(G1 classical strains)和G2變異毒株(G2 variants);G1經(jīng)典毒株又分為2個(gè)進(jìn)化亞支,分別是G1a和G1b,G1a主要是弱毒疫苗株及其衍生毒株,G1b主要是傳統(tǒng)意義上認(rèn)為的田間流行經(jīng)典野毒株。G2變異毒株根據(jù)其遺傳進(jìn)化特點(diǎn)也可以分為3個(gè)進(jìn)化亞支,G2a、G2b 和G2c,其中G2a主要是2011－2013年分離的流行毒株,G2b主要是2016－2017年分離的流行毒株,G2c是2個(gè)已報(bào)道的重組毒株。本研究所獲得的8株序列均屬于G2b進(jìn)化分支,與2016－2017年分離的流行毒株進(jìn)化關(guān)系更近。

2.3 S 1 基因片段的同源性分析利用DNAStar Meg Align(ClustalW method)對(duì)分離序列和參考序列進(jìn)行基因同源性分析顯示(圖2),分離的8株序列彼此核苷酸同源性為97.3%～99.5%,與我國(guó)變異毒株代表毒株AJ1102的同源性最高,為97.2%～98.0%。而與疫苗毒株CV777/CV777 和我國(guó)經(jīng)典毒株CH/S的同源性較低,分別為91.3%～92.3%和91.0%～91.6%。此外,我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)參考毒株JS2008和JSLS-1/2015與疫苗毒株CV777呈現(xiàn)出了很高的核酸序列同源性,分別為99.7%和99.6%。

2.4 S 1基因片段氨基酸變異分析S1基因片段的氨基酸序列分析顯示(圖3),與疫苗毒株CV777/CV777和經(jīng)典毒株CH/S相比,當(dāng)前流行的變異毒株在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了變異,同時(shí)伴隨著氨基酸的插入和缺失。S10(19～211 aa)區(qū)域是氨基酸發(fā)生變異、插入和缺失的主要區(qū)域,共有32個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異,同時(shí)在58NQGV61、140N、157H 這3個(gè)位置有氨基酸的插入,在163NI164有2個(gè)氨基酸的缺失;而S1A(212～511 aa)區(qū)域有9個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異、S1B(512～641 aa)有3個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異、S1CD(642～730 aa)區(qū)域有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異,這3個(gè)區(qū)域相對(duì)保守。除此之外,與其他變異株相比,我們發(fā)現(xiàn)1個(gè)分離株HeNPDS2017在491位新缺失了1個(gè)絲氨酸(Ser)。

表2 參考毒株序列信息

表3 樣品信息及PEDV 檢測(cè)結(jié)果

圖1 基于S 1基因片段的分子進(jìn)化樹分析 ●.表示本研究所獲得的流行毒株序列;■.表示用于制備弱毒疫苗的父母代毒株;□.表示弱毒疫苗毒株;分子進(jìn)化樹是利用MEGA6.0軟件的鄰位法(neighbor-joining method)構(gòu)建

圖2 基于S 1基因片段的核苷酸同源性分析

圖3 基于S1基因片段的氨基酸序列比對(duì)分析 利用MEGA6.0軟件的Clustal W 法進(jìn)行序列比對(duì)分析,黑色方框表示氨基酸插入或者缺失的位置;紅色方框表示弱毒疫苗毒株特有的氨基酸位點(diǎn);星號(hào)表示與廣譜性中和抗體相關(guān)的氨基酸位點(diǎn);黑色箭頭是S10(19～211 aa)、S1 A(212～511 aa)、S1B(512～641 aa)和S1CD(642～730 aa)4個(gè)區(qū)域的位置區(qū)分

3 討論

英國(guó)在1971年首次報(bào)道了PED 的發(fā)生,但直到1978年,才由比利時(shí)科學(xué)家分離到了引起PED的病原-PEDV,并將其中1 個(gè)分離株命名為CV777,這也成為以后開發(fā)滅活疫苗和弱毒疫苗的主要制苗毒株[6]。我國(guó)關(guān)于PED 的描述最早見于1973年,但直到1984 年才分離到該病的病原[14]。2010年以前,PEDV 在我國(guó)主要呈散發(fā)和局部流行,2010年10月份以來,隨著變異株的出現(xiàn),PEDV迅速在我國(guó)豬群中傳播擴(kuò)散,臨床主要表現(xiàn)為新生仔豬的水樣腹瀉,具有很高的發(fā)病率和致死率[1-2,15-16]。2013年,PED 在美國(guó)暴發(fā),隨后的1年時(shí)間,導(dǎo)致了約700 萬頭仔豬的損失[4,17]。目前,PEDV 在世界范圍內(nèi)呈流行態(tài)勢(shì),給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

除了PEDV 可以引起新生仔豬水樣腹瀉外,同屬于冠狀病毒科的TGEV 以及2014年美國(guó)報(bào)道的PDco V 和2017－2018 年我國(guó)報(bào)道的SADS-Co V,也可以引起相似的臨床癥狀[3,7-10]。因此,做好豬腸道冠狀病毒的臨床監(jiān)測(cè)工作,對(duì)于把握豬病毒性腹瀉主要致病病原的流行情況非常重要,也有助于制定針對(duì)性的臨床防控方案。本研究針對(duì)河南省25家養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的94份臨床仔豬腹瀉腸道樣品,開展了仔豬病毒性腹瀉相關(guān)病原的檢測(cè)工作,結(jié)果顯示19家養(yǎng)殖場(chǎng)的腹瀉疫情是由PEDV 的感染導(dǎo)致的,占發(fā)生腹瀉疫情豬場(chǎng)的76.0%;94份臨床樣品中,PEDV 的陽性率為68.1%,但并未檢測(cè)到TGEV、PDco V 和SADS-Co V。提示當(dāng)前河南省引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原為PEDV。需要說明的是,針對(duì)94份臨床樣品,我們并未開展引起仔豬腹瀉的細(xì)菌性病原的相關(guān)檢測(cè)工作,因此細(xì)菌性病原的感染情況或者細(xì)菌性病原與病毒的混合感染情況有待于進(jìn)一步的研究。

為進(jìn)一步分析當(dāng)前PEDV 流行毒株的遺傳變異特征,我們從8家養(yǎng)殖場(chǎng)成功獲得了8株P(guān)EDV的S1基因片段,同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇了36個(gè)參考毒株,進(jìn)行生物信息學(xué)的相關(guān)分析。分子進(jìn)化樹分析顯示,河南省當(dāng)前流行毒株均屬于G2變異株,且處于G2b進(jìn)化分支,主要與2016－2017年的流行株遺傳距離較近,而與2011－2013年的流行株遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn),提示PEDV 變異株在田間流行的過程中,發(fā)生著持續(xù)的變異進(jìn)化。核酸序列同源性分析顯示,分離株與與我國(guó)變異毒株AJ1102的同源性最高,為97.2%～98.0%。而與疫苗毒株CV777和我國(guó)經(jīng)典毒株CH/S的同源性較低,分別為91.3%～92.3% 和91.0%～91.6%。

氨基酸序列比對(duì)分析顯示,與經(jīng)典毒株相比,我國(guó)流行的變異毒株S1基因片段在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸變異,其中S10(19～211 aa)區(qū)是氨基酸發(fā)生變異、插入和缺失的主要區(qū)域,在58NQGV61、140N、157H 這3個(gè)位置有氨基酸的插入,在163NI164位有2個(gè)氨基酸的缺失,S10區(qū)主要與唾液酸的結(jié)合活性和血凝活性相關(guān);而S1A(212～511 aa)、S1B(512～641 aa)和S1CD(642～730 aa)區(qū)則相對(duì)保守,僅有個(gè)別的氨酸酸發(fā)生了變異。此外,與其他變異毒株相比,我們發(fā)現(xiàn)分離株HeNPDS/2017 在491 位有1個(gè)新的絲氨酸(Ser)缺失位點(diǎn),其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步的研究。最近的研究顯示,中和性抗原表位存在于S10和S1B區(qū),且第100 位的苯丙氨酸(Phe)、129位的脯氨酸(Pro)和640位的纈氨酸(Val)對(duì)于抗體的中和活性至關(guān)重要[12]。需要注意的是這3個(gè)氨基酸位點(diǎn)在我國(guó)的經(jīng)典毒株和變異毒株中具有高度的保守性,但現(xiàn)有的商品化疫苗株(CV777、ZJ08和AJ1102)對(duì)PED 的疫情防控效果卻并不理想,提示應(yīng)該有新的中和性抗原表位的存在,并且這一表位與PEDV 的免疫逃逸具有很好的相關(guān)性。因此,關(guān)于PEDV 的中和性抗原表位的鑒定和發(fā)現(xiàn)有待進(jìn)一步的深入研究。

另一個(gè)需要關(guān)注的問題是弱毒疫苗的大量使用導(dǎo)致的疫苗株及其衍生毒株在田間的流行。我們?cè)谧鯯1基因片段的核苷酸同源性分析時(shí),發(fā)現(xiàn)2個(gè)參考毒株JS2008 和JSLS-1/2015 與疫苗毒株CV777具有高度的核苷酸同源性,分別為99.7%和99.6%。進(jìn)一步的氨基酸序列比對(duì)分析顯示,三者具有高度一致的氨基酸序列,并且有多個(gè)氨基酸位點(diǎn)(圖3紅色方框內(nèi))是疫苗毒株CV777所特有的,提示JS2008和JSLS-1/2015這2個(gè)參考毒株極有可能是疫苗衍生毒株。

總之,本研究分析了2017年河南省引起仔豬腹瀉的主要病毒性病原的流行情況,確定了當(dāng)前引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原依然是PEDV。同時(shí)基于分離株的S1 基因片段的遺傳進(jìn)化和同源性分析,確定了當(dāng)前河南省PEDV 流行株均屬于變異毒株,且處于G2b進(jìn)化分支。氨基酸序列分析顯示,與經(jīng)典毒株相比,變異毒株具有特征性的氨基酸插入和缺失等遺傳標(biāo)記;此外,我們發(fā)現(xiàn)分離株HeNPDS/2017在491位有1個(gè)新的絲氨酸(Ser)缺失位點(diǎn),提示隨著時(shí)間的推移,變異毒株依然在發(fā)生著快速的遺傳演變。這對(duì)PEDV 的臨床防控構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn),也需要進(jìn)一步加大PEDV 的基礎(chǔ)研究工作,從而為PEDV 的成功防控提供理論支撐。