張榮 陳婧 黃江濤 呂海龍 楊一邨 王浩斌 張抒

對氧磷酶-1(paraoxonase 1，PON1)是一種具有調(diào)控血脂和抗炎特性的細(xì)胞外酯酶，參與調(diào)控動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[1, 2]。研究發(fā)現(xiàn)，PON1通過上調(diào)GLUT4和IRS-1/Akt信號通路參與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，影響二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等多種代謝疾病[3，4]。研究證實，NAFLD患者外周血中PON1活性顯著降低[5, 6]。本研究通過分析NAFLD患者外周血PON1活性和含量，以及其與血糖、血脂、胰島素抵抗等指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，探究其可能的作用機(jī)制。

資料與方法

一、病例來源

選取2018年3月至2019年1月成都市第三人民醫(yī)院收治的NAFLD患者129例，男79例，女50例，年齡(47.9±1.1)歲。同時選擇130例無NAFLD患者作為對照，其中男72例，女58例，年齡(48.5±0.9)歲。兩組性別、年齡比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.552,t=0.153,均P>0.05)。比較兩組研究對象身高、體質(zhì)指數(shù)、腰圍、血壓、血糖、血脂、肝腎功能、胰高血糖素、胰島素水平。所有研究對象均自愿參與，并簽署知情同意書。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

(一)胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)指數(shù)評估 胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)指數(shù)(homeostatic index of insulin resistance，HOMA-IR)通過穩(wěn)態(tài)模型評價，計算公式為：HOMA-IR=(空腹血糖值×空腹血胰島素值)/22.51。

(二)人外周血PON1活性和含量檢測 應(yīng)用PON1活性檢測試劑盒(美國Cusabio公司)和PON1含量檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)，按照說明書進(jìn)行操作。常規(guī)收集患者血漿后，加入200 μL至包被PON1抗體的96孔板中孵育12 h，隨即漂洗并依次加入顯色底物和終止液，測定450 nm的吸光度值，計算PON1活性。PON1含量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算，100 μL血漿加入至96孔板中，37℃孵育1 h，依次加入工作液和TMB底物，并測定450 nm的吸光值。

(三)細(xì)胞培養(yǎng)和處理 12孔板接種2.5×105個LO2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mmol 油酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶液處理24 h或10 ng/mL TNF-α處理6 h，以PEI轉(zhuǎn)染1 μg空載質(zhì)粒和PDEST42-hPON1-V5質(zhì)粒(北京奧克鼎盛生物技術(shù)有限公司)24 h。

(四)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量測量 使用尼羅紅染料(大連美侖生物技術(shù)有限公司)測定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。處理24 h后，更換為含有1 μg/ mL尼羅紅的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在黑暗中于37℃溫育30 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞并于ZOE熒光成像儀捕獲熒光圖像。

(五)蛋白質(zhì)印跡檢測 藥物處理的12孔板LO2細(xì)胞以PBS洗去多余培養(yǎng)基，加入100 μL含cocktail和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰水浴剪碎后超聲破碎，冷卻并冰上裂解10 min，12 000×g離心20 min，取上清至新Ep管中，采用BCA法檢測濃度后，加入含β-BE的5X loading buffer，95℃干熱變性10 min，8%SDS-PAGE分離膠電泳分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜上，2%BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，分別加入抗人PON1、p-AKT(Ser473)、總AKT(T-AKT)、p-IRS-1(Ser307)、總IRS-1(T-IRS-1)、FAS、HMGCR、SREBP2、SREBP1C和β-actin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)，4 ℃搖床孵育12 h。TBST室溫漂洗3次。孵育HRP二抗TBST溶液(以1∶10 000稀釋)室溫2 h。ECL發(fā)光顯示。蛋白表達(dá)以Image J計算總灰度值表示，標(biāo)準(zhǔn)化至β-actin灰度值。

(六)統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、非酒精性脂肪肝患者和無非酒精性脂肪肝患者一般資料比較

NAFLD患者腰圍、BMI、ALT和AST明顯增加，外周血PON1活性和含量顯著降低。見表1。

二、非酒精性脂肪肝和無非酒精性脂肪肝患者血脂分析

NAFLD患者外周血FFA、TG、TC、LDL-C和VLDL-C顯著升高，HDL-C明顯降低。見表2。

三、非酒精性脂肪肝和無非酒精性脂肪肝患者胰島素抵抗和脂肪因子變化分析

NAFLD患者空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、抵抗素、瘦素、IL-6和TNF-α明顯升高，胰高血糖素和脂聯(lián)素顯著降低。見表3。

表1 非酒精性脂肪肝和無酒精性脂肪肝患者臨床指標(biāo)比較(±s)

表2 非酒精性脂肪肝和無非酒精性脂肪肝患者血脂特點(±s)

表3 非酒精性脂肪肝和無非酒精性脂肪肝患者胰島素抵抗和脂肪因子變化特點(±s)

四、非酒精性脂肪肝患者PON1活性和含量與胰島素抵抗和脂肪因子的相關(guān)性

NAFLD患者外周血PON1活性和含量與FFAs、TG、TC、LDL-C、VLDL-C、空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、抵抗素、瘦素、IL-6和TNF-α顯著呈負(fù)相關(guān)，與DL-C、胰高血糖素和脂聯(lián)素顯著呈正相關(guān)。見表4。

五、過表達(dá)PON1減少OA誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪變性

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著降低OA誘導(dǎo)LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量升高。見圖1。

六、過表達(dá)Paraoxonase 1抑制TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞胰島素抵抗

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著增加PON1，同時p-IRS1和p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增加。見圖2。

七、過表達(dá)Paraoxonase 1抑制TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪代謝

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著增加FAS、HMGCR、SREBP2和SREBP1C蛋白表達(dá)。見圖3。

表4 非酒精性脂肪肝患者PON1活性和含量與NAFLD患者血脂含量、胰島素抵抗和脂肪因子顯著相關(guān)(±s)

**P<0.01;***P<0.001

A: LO2細(xì)胞PON1活性水平；B：LO2細(xì)胞尼羅紅染料染色；C：LO2細(xì)胞內(nèi)甘油三酸酯含量；D：PON1-V5蛋白水平電泳圖

圖1Paraoxonase 1調(diào)控OA誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪變性

A:PON1，p-AKT，t-AKT，p-IRS1，T-IRS1蛋白水平條帶圖；B：p-AKT，p-IRS1蛋白水平

圖2Paraoxonase 1調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞胰島素抵抗

A:FAS，HMGCR，SREBP2，SREBP1C蛋白水平條帶圖；B：p-AKT，p-IRS1蛋白水平

圖3Paraoxonase 1調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的LO2脂質(zhì)代謝

討 論

臨床數(shù)據(jù)表明，NAFLD患者常伴有代謝紊亂和胰島素抵抗，通過干預(yù)脂質(zhì)運(yùn)輸可顯著控制其病死率[7,8]。文獻(xiàn)報道，NAFLD患者外周血中PON1活性顯著降低[9]，而PON1具有血脂調(diào)節(jié)、抗炎癥特性，參與調(diào)控胰島素抵抗[4,10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD降低PON1含量和活性與自身血脂水平和胰島素抵抗及相關(guān)因子密切相關(guān)[4,11]。經(jīng)選取公認(rèn)的OA誘導(dǎo)的脂肪變性和TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗LO2細(xì)胞模型[3, 12]，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在該模型中過表達(dá)PON1，分析其對胰島素抵抗和脂肪代謝的影響和機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PON1顯著抑制細(xì)胞脂肪變性和胰島素抵抗，并且其與IRS1/AKT通路作用有關(guān)[4,13]，其上調(diào)FAS，HMGCR，REBP2和SREBP1C增強(qiáng)脂質(zhì)代謝[14,15]。

綜上所述，本研究分析NAFLD外周血PON1與血脂、血糖、胰島素抵抗和脂肪因子等與NAFLD密切相關(guān)的蛋白的關(guān)聯(lián)性，證實其可作用IRS1/AKT通路參與胰島素抵抗調(diào)節(jié)，作用FAS、HMGCR、REBP2和SREBP1C參與脂再生和脂肪氧化代謝。然而，其具體如何調(diào)控這些蛋白仍待進(jìn)一步研究。