張榮 陳婧 黃江濤 呂海龍 楊一邨 王浩斌 張抒

對(duì)氧磷酶-1(paraoxonase 1，PON1)是一種具有調(diào)控血脂和抗炎特性的細(xì)胞外酯酶，參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展[1, 2]。研究發(fā)現(xiàn)，PON1通過(guò)上調(diào)GLUT4和IRS-1/Akt信號(hào)通路參與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，影響二型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等多種代謝疾病[3，4]。研究證實(shí)，NAFLD患者外周血中PON1活性顯著降低[5, 6]。本研究通過(guò)分析NAFLD患者外周血PON1活性和含量，以及其與血糖、血脂、胰島素抵抗等指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，探究其可能的作用機(jī)制。

資料與方法

一、病例來(lái)源

選取2018年3月至2019年1月成都市第三人民醫(yī)院收治的NAFLD患者129例，男79例，女50例，年齡(47.9±1.1)歲。同時(shí)選擇130例無(wú)NAFLD患者作為對(duì)照，其中男72例，女58例，年齡(48.5±0.9)歲。兩組性別、年齡比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.552,t=0.153,均P>0.05)。比較兩組研究對(duì)象身高、體質(zhì)指數(shù)、腰圍、血壓、血糖、血脂、肝腎功能、胰高血糖素、胰島素水平。所有研究對(duì)象均自愿參與，并簽署知情同意書(shū)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

(一)胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)指數(shù)評(píng)估 胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)指數(shù)(homeostatic index of insulin resistance，HOMA-IR)通過(guò)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)價(jià)，計(jì)算公式為：HOMA-IR=(空腹血糖值×空腹血胰島素值)/22.51。

(二)人外周血PON1活性和含量檢測(cè) 應(yīng)用PON1活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Cusabio公司)和PON1含量檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。常規(guī)收集患者血漿后，加入200 μL至包被PON1抗體的96孔板中孵育12 h，隨即漂洗并依次加入顯色底物和終止液，測(cè)定450 nm的吸光度值，計(jì)算PON1活性。PON1含量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，100 μL血漿加入至96孔板中，37℃孵育1 h，依次加入工作液和TMB底物，并測(cè)定450 nm的吸光值。

(三)細(xì)胞培養(yǎng)和處理 12孔板接種2.5×105個(gè)LO2細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 mmol 油酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶液處理24 h或10 ng/mL TNF-α處理6 h，以PEI轉(zhuǎn)染1 μg空載質(zhì)粒和PDEST42-hPON1-V5質(zhì)粒(北京奧克鼎盛生物技術(shù)有限公司)24 h。

(四)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量測(cè)量 使用尼羅紅染料(大連美侖生物技術(shù)有限公司)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。處理24 h后，更換為含有1 μg/ mL尼羅紅的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在黑暗中于37℃溫育30 min，然后用PBS洗滌細(xì)胞并于ZOE熒光成像儀捕獲熒光圖像。

(五)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 藥物處理的12孔板LO2細(xì)胞以PBS洗去多余培養(yǎng)基，加入100 μL含cocktail和磷酸化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰水浴剪碎后超聲破碎，冷卻并冰上裂解10 min，12 000×g離心20 min，取上清至新Ep管中，采用BCA法檢測(cè)濃度后，加入含β-BE的5X loading buffer，95℃干熱變性10 min，8%SDS-PAGE分離膠電泳分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)1 h至PVDF膜上，2%BSA的TBST溶液室溫封閉1 h，分別加入抗人PON1、p-AKT(Ser473)、總AKT(T-AKT)、p-IRS-1(Ser307)、總IRS-1(T-IRS-1)、FAS、HMGCR、SREBP2、SREBP1C和β-actin抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)，4 ℃搖床孵育12 h。TBST室溫漂洗3次。孵育HRP二抗TBST溶液(以1∶10 000稀釋)室溫2 h。ECL發(fā)光顯示。蛋白表達(dá)以Image J計(jì)算總灰度值表示，標(biāo)準(zhǔn)化至β-actin灰度值。

(六)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、非酒精性脂肪肝患者和無(wú)非酒精性脂肪肝患者一般資料比較

NAFLD患者腰圍、BMI、ALT和AST明顯增加，外周血PON1活性和含量顯著降低。見(jiàn)表1。

二、非酒精性脂肪肝和無(wú)非酒精性脂肪肝患者血脂分析

NAFLD患者外周血FFA、TG、TC、LDL-C和VLDL-C顯著升高，HDL-C明顯降低。見(jiàn)表2。

三、非酒精性脂肪肝和無(wú)非酒精性脂肪肝患者胰島素抵抗和脂肪因子變化分析

NAFLD患者空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、抵抗素、瘦素、IL-6和TNF-α明顯升高，胰高血糖素和脂聯(lián)素顯著降低。見(jiàn)表3。

表1 非酒精性脂肪肝和無(wú)酒精性脂肪肝患者臨床指標(biāo)比較(±s)

表2 非酒精性脂肪肝和無(wú)非酒精性脂肪肝患者血脂特點(diǎn)(±s)

表3 非酒精性脂肪肝和無(wú)非酒精性脂肪肝患者胰島素抵抗和脂肪因子變化特點(diǎn)(±s)

四、非酒精性脂肪肝患者PON1活性和含量與胰島素抵抗和脂肪因子的相關(guān)性

NAFLD患者外周血PON1活性和含量與FFAs、TG、TC、LDL-C、VLDL-C、空腹血糖、胰島素、HOMA-IR、抵抗素、瘦素、IL-6和TNF-α顯著呈負(fù)相關(guān)，與DL-C、胰高血糖素和脂聯(lián)素顯著呈正相關(guān)。見(jiàn)表4。

五、過(guò)表達(dá)PON1減少OA誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪變性

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著降低OA誘導(dǎo)LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量升高。見(jiàn)圖1。

六、過(guò)表達(dá)Paraoxonase 1抑制TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞胰島素抵抗

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著增加PON1，同時(shí)p-IRS1和p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增加。見(jiàn)圖2。

七、過(guò)表達(dá)Paraoxonase 1抑制TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪代謝

轉(zhuǎn)染PON1質(zhì)粒顯著增加FAS、HMGCR、SREBP2和SREBP1C蛋白表達(dá)。見(jiàn)圖3。

表4 非酒精性脂肪肝患者PON1活性和含量與NAFLD患者血脂含量、胰島素抵抗和脂肪因子顯著相關(guān)(±s)

**P<0.01;***P<0.001

A: LO2細(xì)胞PON1活性水平；B：LO2細(xì)胞尼羅紅染料染色；C：LO2細(xì)胞內(nèi)甘油三酸酯含量；D：PON1-V5蛋白水平電泳圖

圖1Paraoxonase 1調(diào)控OA誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞脂肪變性

A:PON1，p-AKT，t-AKT，p-IRS1，T-IRS1蛋白水平條帶圖；B：p-AKT，p-IRS1蛋白水平

圖2Paraoxonase 1調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞胰島素抵抗

A:FAS，HMGCR，SREBP2，SREBP1C蛋白水平條帶圖；B：p-AKT，p-IRS1蛋白水平

圖3Paraoxonase 1調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的LO2脂質(zhì)代謝

討 論

臨床數(shù)據(jù)表明，NAFLD患者常伴有代謝紊亂和胰島素抵抗，通過(guò)干預(yù)脂質(zhì)運(yùn)輸可顯著控制其病死率[7,8]。文獻(xiàn)報(bào)道，NAFLD患者外周血中PON1活性顯著降低[9]，而PON1具有血脂調(diào)節(jié)、抗炎癥特性，參與調(diào)控胰島素抵抗[4,10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD降低PON1含量和活性與自身血脂水平和胰島素抵抗及相關(guān)因子密切相關(guān)[4,11]。經(jīng)選取公認(rèn)的OA誘導(dǎo)的脂肪變性和TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗LO2細(xì)胞模型[3, 12]，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在該模型中過(guò)表達(dá)PON1，分析其對(duì)胰島素抵抗和脂肪代謝的影響和機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PON1顯著抑制細(xì)胞脂肪變性和胰島素抵抗，并且其與IRS1/AKT通路作用有關(guān)[4,13]，其上調(diào)FAS，HMGCR，REBP2和SREBP1C增強(qiáng)脂質(zhì)代謝[14,15]。

綜上所述，本研究分析NAFLD外周血PON1與血脂、血糖、胰島素抵抗和脂肪因子等與NAFLD密切相關(guān)的蛋白的關(guān)聯(lián)性，證實(shí)其可作用IRS1/AKT通路參與胰島素抵抗調(diào)節(jié)，作用FAS、HMGCR、REBP2和SREBP1C參與脂再生和脂肪氧化代謝。然而，其具體如何調(diào)控這些蛋白仍待進(jìn)一步研究。