■林 淼 陳志遠(yuǎn) 鞏 帥 封麗梅 王闊鵬 胡梓軒

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

硝酸鹽是一種非蛋白氮類型，在瘤胃中可被微生物還原，以亞硝酸鹽為中間產(chǎn)物最終生成氨，并再次被微生物利用，合成菌體蛋白[1]。因此，目前認(rèn)為瘤胃微生物是調(diào)控硝酸鹽還原的主要原因。林淼等[2]的體外培養(yǎng)試驗(yàn)表明，瘤胃細(xì)菌和原蟲是主要的硝酸鹽還原微生物，而真菌對其的還原能力忽略不計(jì)。目前報(bào)道的硝酸鹽還原菌主要包括反芻獸新月單胞菌（Selenomonas ruminantium）、小韋榮氏球菌（Veillonella parvula）、產(chǎn)琥珀酸沃廉菌（Wolinella succinogenes）、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）、胎兒彎曲桿菌（Campylobacter fetus），其中反芻獸新月單胞菌的數(shù)量最多[3-5]。Zhou等[6]體外培養(yǎng)研究表明，添加5 mM 硝酸鹽降低了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌，瘤胃白色球菌和瘤胃黃色球菌的豐度，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長、瘤胃白色球菌和瘤胃黃色球菌的數(shù)量增加，說明瘤胃內(nèi)的某些細(xì)菌能夠適應(yīng)硝酸鹽。Zhao等[7]在肉牛日糧中添加2%硝酸鹽（干物質(zhì)基礎(chǔ)）增加了反芻獸新月單胞菌、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌和胎兒彎曲桿菌的相對豐度。目前硝酸鹽對湖羊瘤胃微生物區(qū)系影響的研究較少。本試驗(yàn)在湖羊日糧中添加不同劑量的硝酸鉀，采集瘤胃液進(jìn)行16S rDNA 測序分析，研究硝酸鹽對瘤胃細(xì)菌的影響，對明確硝酸鹽在瘤胃內(nèi)的微生物還原機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取3頭9月齡，體重相近（30±5）kg且裝有永久性瘤胃瘺管的健康湖羊，日糧配方參照參照NRC（2007）的成年羊的營養(yǎng)需要，具體營養(yǎng)成分見表1。以不添加硝酸鉀為對照（A），逐量增加硝酸鉀的添加量至6（B）、12（C）、18（D）、24（E）、30（F）g/d。每個(gè)添加梯度設(shè)置14 d 預(yù)試期，2 d 采樣期。試驗(yàn)羊每天飼喂兩次（9:00和16:00），自由飲水，保持羊舍適宜的光照和通風(fēng)，定期消毒。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和DNA提取

采集晨飼后2 h的瘤胃內(nèi)容物，以4層紗布過濾，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，使用糞便基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取總DNA，用微量核酸蛋白檢測儀測定DNA 濃度，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 高通量測序

用無菌超純水稀釋DNA 樣品濃度至1 ng/μl，使用帶Barcode 的引物序列515F 5’GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3’，806R 5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’擴(kuò)增16S V4區(qū)，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣。使用New England Biolabs 公司的NEB Next?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，再經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后，在Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測序（諾禾致源生物信息科技公司，北京）。

Illumina Miseq 雙末端測序結(jié)束后，根據(jù)Barcode序列將拆分下機(jī)數(shù)據(jù)，并截去Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列。將拆分的數(shù)據(jù)使用FLASH (V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對每個(gè)樣品的reads 進(jìn)行拼接，得到有效序列。將有效序列進(jìn)行去雜過濾掉，其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于序列長度75%的序列，去除嵌合體，最終得到可用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。使用Uparse 軟件將相似性大于97%的序列聚為一個(gè)OTU。通過RDP 數(shù)據(jù)庫對OTU 進(jìn)行分類和物種注釋，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品在不同水平（門、綱、目、科、屬）的物種分類。本試驗(yàn)使用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)來評(píng)定細(xì)菌群落的多樣性和豐富度。Shannon指數(shù)代表微生物群落的多樣性，Chao1 指數(shù)代表微生物群落的豐富度。通過層次聚類（Hierarchical clustering）中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）進(jìn)化樹。所有參數(shù)使用在線Mothur軟件制作(http://www.mothur.org)。

1.2.3 Real-time PCR分析

引物序列具體見表2[5]。

表2 熒光定量PCR引物

冰上配制反應(yīng)體系，在羅氏Light Cycler? 96 PCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件為：95 ℃、600 s；95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、10 s；45個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式2-△△ct，其中-△△ct=-（待測組目的基因平均ct值-待測組內(nèi)參基因平均ct 值）-（對照組目的基因平均ct 值-對照組內(nèi)參基因平均ct 值），計(jì)算基因表達(dá)量的相對倍數(shù)。PCR 產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS9.2軟件的PROC MIXED 模型進(jìn)行方差分析，并用Tukey's法進(jìn)行差異顯著性比較，對于不同處理指標(biāo)，在不服從正態(tài)分布時(shí)，做非參數(shù)檢驗(yàn)重新分析顯著性，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鹽劑量對瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)的分析

本次測序共得到485 440條raw tags，經(jīng)過處理后得到481 526條effective tags，平均每個(gè)樣品含26 751條序列。以97%相似度作為閾值，共得到9 277個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品515 個(gè)OTU。由表3 可以看出，隨著日糧硝酸鉀劑量的增加，各組間的Shannon 指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著差異。

2.2 硝酸鹽劑量對瘤胃細(xì)菌群落的影響

表3 硝酸鹽劑量對細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)的影響

表4 硝酸鹽劑量對瘤胃細(xì)菌相對豐度的影響（門水平）

由表4 可見，湖羊瘤胃內(nèi)擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度總和占90%以上，說明這3 個(gè)細(xì)菌門在本試驗(yàn)的瘤胃細(xì)菌群落中為優(yōu)勢菌群。C和D組的擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度最高（P＜0.05），其它各菌門豐度在各組間無顯著差異。

不同硝酸鉀劑量的瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚類結(jié)果（見圖1）顯示，不同硝酸鹽劑量的瘤胃細(xì)菌區(qū)系分為三大類，C和D組之間具有很高的相似性，E和F組之間具有很高的相似性。A和B組相似。

為進(jìn)一步探究瘤胃的菌群結(jié)構(gòu)，選取屬水平上豐度排名前35 的細(xì)菌繪制熱圖并聚類（見圖2）。由圖可知，C 和D 組的普雷沃氏菌屬（Prevotella）相對豐度最高（P＜0.05），其它菌屬豐度在各組間無顯著差異。

圖2 硝酸鹽劑量對瘤胃細(xì)菌相對豐度的影響（屬水平，前20）

為分析瘤胃細(xì)菌群落與發(fā)酵參數(shù)間的關(guān)系，以細(xì)菌群落在屬水平上的相對豐度前20的數(shù)據(jù)為物種數(shù)據(jù)，瘤胃液中日糧硝酸鹽添加量、亞硝態(tài)氮含量、pH值、氨態(tài)氮含量為變量，進(jìn)行了Speraman 分析，見圖3。由圖可知，相對豐度前20 的瘤胃細(xì)菌屬與日糧硝酸鹽添加量之間無顯著相關(guān)關(guān)系，甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）的相對豐度與亞硝態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)（P=0.006，r=0.624 0）；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）（P=0.016，r=-0.560 4）與氨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)；梭狀桿菌屬（Clostridium）、菌屬（Shuttleworthia）、糞球菌屬（Coprococcus）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、假丁酸弧菌屬（Pseudobutyrivibrio）的相對豐度與瘤胃液pH 值呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，r=0.499 7-0.602 0），普雷沃氏菌屬（Prevotella）的相對豐度與瘤胃液pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.028，r=-0.518 3）。

基于OTU 水平細(xì)菌群落與硝態(tài)氮還原產(chǎn)物進(jìn)行RDA分析，結(jié)果見圖4。有圖可知，第1排和第2排序軸分別可解釋細(xì)菌群落組成變異的36.1%和24.68%。瘤胃液pH 值與第一排序軸的關(guān)系較近（r=0.946 4），亞硝態(tài)氮?dú)埩袅亢桶睉B(tài)氮與第二排序軸的關(guān)系較近（r=0.472 3，0.596 3）。亞硝態(tài)氮?dú)埩袅?、瘤胃液氨態(tài)氮含量和pH值與日糧硝酸鉀添加量呈正相關(guān)關(guān)系，瘤胃液氨態(tài)氮含量與瘤胃液pH 值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。未添加硝酸鉀3個(gè)平行樣本（A1、A2、A3）較集中，日糧添加18 g/d 和24 g/d 硝酸鉀的3 個(gè)平行樣本（D1、D2、D3；E1、E2、E3）較集中，且隨著硝酸鉀添加量的升高，個(gè)體動(dòng)物的細(xì)菌區(qū)系離散程度增加，說明硝酸鉀改變了瘤胃細(xì)菌區(qū)系，但存在個(gè)體差異。

2.3 硝酸鹽劑量對瘤胃硝酸鹽還原菌相對豐度的影響

挖掘高通量測序結(jié)果，未檢測到有顯著性差異的細(xì)菌種類，且相對豐度均較低。因此，本試驗(yàn)采用RT-PCR 方法進(jìn)一步研究已報(bào)道的硝酸鹽還原菌相對豐度的差別。由圖5 可知，反芻獸新月單胞菌（S.ruminantium）的相對豐度在各硝酸鹽劑量間無顯著影響。相反，胎兒彎曲桿菌（C. fetus）的相對豐度隨硝酸鹽添加量的增加逐漸上升，F(xiàn)組最高（P＜0.01），D組和E組顯著高于A組和B組（P＜0.01）。

3 討論

硝酸鹽可為瘤胃微生物提供氮源，并且經(jīng)還原生成氨[1]。硝酸鹽對瘤胃液氨態(tài)氮水平和pH 值的影響結(jié)果不一致。Zhao等[7]報(bào)道，占日糧2%的硝酸鹽不影響瘤胃液氨態(tài)氮含量和pH 值，而不同研究表明添加硝酸鹽可提高瘤胃液氨態(tài)氮水平和pH值[4，7]。本試驗(yàn)關(guān)聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)硝酸鹽添加量與氨態(tài)氮和pH值呈正相關(guān)關(guān)系，這與前人結(jié)果相似。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)底物中加入5 mmol/l硝酸鹽，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)無顯著差異[8]，劉麗慧等[9]體外研究表明，5 mmol/l 的硝酸鈉不影響瘤胃細(xì)菌總數(shù)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，湖羊日糧硝酸鉀劑量達(dá)30 g/d 時(shí)不影響瘤胃細(xì)菌群落的多樣性和豐度。本試驗(yàn)通過16S rDNA測序?qū)﹂T水平湖羊瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門，與Perumbakkam等[10]的研究一致。Kim等[11]的研究同樣證明了，這三個(gè)菌門構(gòu)成了瘤胃的核心菌群。擬桿菌門大部分為革蘭氏陰性菌，多數(shù)菌屬有很高的多糖降解活性，擁有大量多糖分解酶基因[12-13]。Fernando 等[14]用16S rRNA 基因文庫的方法研究肉牛瘤胃微生物發(fā)現(xiàn)，采食高精料日糧組，瘤胃中擬桿菌門所占比例顯著升高，這與本試驗(yàn)選用較高精料比例日糧的結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，擬桿菌門的相對豐度隨日糧硝酸鉀劑量的增加而先上升后下降，最高豐度時(shí)硝酸鹽劑量為12 g/d 和18 g/d。可見，適當(dāng)?shù)南跛徕泟┝靠稍黾訑M桿菌門的相對豐度，但過高的日糧硝酸鉀抑制擬桿菌門的增殖活動(dòng)。

圖3 瘤胃細(xì)菌相對豐度與發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析（屬水平）

普雷沃氏菌屬為擬桿菌門內(nèi)的優(yōu)勢菌屬。Stevenson等[15]使用Real-time PCR的方法，對兩頭荷斯坦奶牛瘤胃液分析發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬的相對豐度為42%～60%?？梢?，該菌屬是瘤胃中的常駐菌屬，并且有很高的豐度。普雷沃氏菌屬是擁有高活性的降解半纖維素的菌種[16]。與擬桿菌門相似，普雷沃氏菌屬的相對豐度在日糧含有硝酸鉀12 g/d 和18 g/d 時(shí)最高，并隨著硝酸鉀劑量的升高而下降，說明該菌屬豐度受硝酸鉀劑量的影響。關(guān)于普雷沃氏菌的相對豐度與pH值之間的關(guān)系報(bào)道不一致。林波等[17]報(bào)道全粗料日糧使普雷沃氏菌科的相對豐度顯著升高，Zhao等[7]報(bào)道添加硝酸鹽不改變?nèi)馀Ａ鑫敢浩绽孜质暇鷮傧鄬ωS度。本研究結(jié)果表明普雷沃氏菌屬相對豐度與瘤胃液pH值呈顯著負(fù)相關(guān)。不同的結(jié)果原因可能是硝酸鹽的添加劑量及動(dòng)物品種差異導(dǎo)致。厚壁菌門中以纖維分解菌為主[18]，本試驗(yàn)檢測到的5 種與瘤胃液pH值呈顯著相關(guān)的菌屬均屬于厚壁菌門。本試驗(yàn)中瘤胃球菌屬相對豐度與瘤胃液硝酸鹽添加量無顯著相關(guān)關(guān)系，這與Wang 等[1]的研究結(jié)果一致；Patra等[19]研究也表明黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌相對豐度不受硝酸鹽的影響。本試驗(yàn)丁酸弧菌屬、梭狀桿菌屬、糞球菌屬的相對豐度與pH 值呈顯著正相關(guān)，但不受硝酸鹽添加劑量的影響，這與Zhao 等[7]結(jié)果相似。

圖4 瘤胃細(xì)菌相對豐度與硝態(tài)氮發(fā)酵參數(shù)相關(guān)性分析（屬水平）

圖5 不同硝酸鹽添加量對反芻獸新月單胞菌和胎兒彎曲桿菌相對豐度的影響

反芻獸新月單胞菌是Iwamoto 等[3]研究提出的瘤胃還原硝酸鹽的細(xì)菌（反芻獸新月單胞菌，小韋榮氏球菌和產(chǎn)琥珀酸沃廉菌）中起主要作用且數(shù)量最多的細(xì)菌。Asanuma等[4]證明該菌在硝酸鹽還原過程中發(fā)揮著重要作用，且能夠降解淀粉等可溶性碳水化合物。Yoshii 等[20]的研究表明，淀粉分解菌能增強(qiáng)反芻獸新月單胞菌還原硝酸鹽的能力。本試驗(yàn)中小韋榮氏球菌和產(chǎn)琥珀酸沃廉菌并未出現(xiàn)在排名前20的屬中，可能因?yàn)檫@兩種菌在瘤胃內(nèi)的含量極少。本試驗(yàn)通過Real-time PCR 可以看出，各組間反芻獸新月單胞菌的基因拷貝數(shù)并無顯著差異，與16S rDNA 高通量測序結(jié)果一致。胎兒彎曲桿菌在瘤胃內(nèi)的總量很少[5,7]，且多報(bào)道為病原菌[21]。但該菌可隨硝酸鹽添加量的升高而升高，并具有潛在的還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力[5]。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。盡管本研究前期結(jié)果表明動(dòng)物血液中的高鐵血紅蛋白含量隨硝酸鹽添加量的增加而升高，但未出現(xiàn)中毒癥狀[22]，由于胎兒彎曲桿菌的病原性，本試驗(yàn)推測過高劑量的硝酸鹽對瘤胃細(xì)菌正常區(qū)系有一定的危害。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同日糧硝酸鉀劑量對湖羊瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是優(yōu)勢菌群。日糧含12 g/d和18 g/d的硝酸鉀增加了湖羊瘤胃擬桿菌門、普雷沃氏菌屬和胎兒彎曲桿菌的相對豐度，但過高的硝酸鉀抑制優(yōu)勢菌群的增殖。