戚 婧，陳紅影，劉起華，鄭 偉，李志慧，陳建華，黃運(yùn)芳，張 婷，魏桂杰，張玉杰＊＊，馬鵬凱＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102844；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 10053）

糖尿病被中醫(yī)稱作“消渴”，是一種以糖代謝異常為主要特點(diǎn)的代謝疾病群，嚴(yán)重威脅人類健康和壽命的常見(jiàn)慢性疾病。糖尿病及其并發(fā)癥是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病。對(duì)糖尿病的用藥治療上有著非常悠久的歷史，并積累了諸多的經(jīng)驗(yàn)。如中醫(yī)古籍《名醫(yī)別錄》《后肘備急方》《本草綱目》等均有黃連“止消渴”的詳細(xì)方藥記載[1]。

現(xiàn)代研究表明，黃連的主要藥效成分為生物堿，包括小檗堿、巴馬汀、防己堿、小檗紅堿、藥根堿、黃連堿（Coptisine，COP），均具有確切的抗炎、降血糖、降血脂、抗老年癡呆等廣泛的藥理學(xué)作用[2]。其中，COP 是一種天然的原小檗堿類生物堿，主要存在于毛茛科和罌粟科的多種植物中，資源豐富且藥理作用廣泛，是除小檗堿之外，含量較高的原小檗堿類生物堿之一，有利于血液中的葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低血糖濃度，這說(shuō)明在治療糖尿病方面COP 有潛在的藥效[3]。COP 與小檗堿有相同的母體結(jié)構(gòu)，兩者結(jié)構(gòu)差異小，生物活性較高。COP 作用主要包括抑制A 型單胺氧化酶、選擇性抑制和雙重抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制破骨細(xì)胞分化的功能、選擇性調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞中的多藥耐藥蛋白質(zhì)等[4-8]。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，COP具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)于藥物體內(nèi)的代謝研究，不僅是藥性評(píng)價(jià)的重要組成部分，更是影響藥物作用的最重要的因素之一。不僅對(duì)于化合物的體內(nèi)處置過(guò)程研究有重要意義，對(duì)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及其毒性或反應(yīng)性代謝物的體內(nèi)清除過(guò)程同樣起到關(guān)鍵作用。藥物在體內(nèi)發(fā)揮藥理活性后大多排出體外，在這個(gè)過(guò)程中，代謝酶、藥物性質(zhì)、藥物劑量以及病理狀態(tài)等都對(duì)藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程有重要影響。因此，對(duì)于全面了解化合物在體內(nèi)的代謝過(guò)程，做進(jìn)一步研究藥物如何在病理狀態(tài)下發(fā)揮作用具有十分重要的意義[7]。

數(shù)十年的臨床研究表明，糖尿病患者服用黃連可以有效控制其血糖水平，推測(cè)是由于黃連中有效成分能夠降低胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，降低胰高血糖素，且患者長(zhǎng)期服用無(wú)明顯毒副作用，相較于傳統(tǒng)西藥治療，中藥治療療效顯著，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。同時(shí)，病理狀態(tài)可能會(huì)使轉(zhuǎn)運(yùn)體功能發(fā)生明顯的改變，這種改變會(huì)使藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程受到顯著的影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致療效增強(qiáng)或產(chǎn)生藥物毒副作用[9]。因此，研究藥物在病理狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物和代謝途徑對(duì)于闡明藥物藥理機(jī)制、明確藥物發(fā)揮活性的物質(zhì)基礎(chǔ)、指導(dǎo)臨床合理用藥等方面具有重要意義[10]。通過(guò)對(duì)COP 藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比較，黃連堿在糖尿病模型大鼠體內(nèi)的生物利用度顯著提高[8]，推測(cè)其在糖尿病狀態(tài)下的代謝行為可能發(fā)生了改變，故有必要對(duì)其體內(nèi)代謝過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

目前，對(duì)中藥的開(kāi)發(fā)研究，主要集中在糖尿病并發(fā)癥的防控方面，大大限制了中藥的臨床應(yīng)用，對(duì)于中藥降血糖的病理機(jī)制以及病理狀態(tài)下的代謝過(guò)程研究并不深入。雖然目前很多文獻(xiàn)表明中藥對(duì)于降糖的作用顯著，但臨床上中藥的降糖應(yīng)用遠(yuǎn)不如西藥的應(yīng)用頻率，導(dǎo)致臨床基礎(chǔ)研究?jī)?yōu)勢(shì)并不突出[9]。因此，研究藥物的代謝產(chǎn)物和代謝途徑對(duì)于闡明藥物藥理機(jī)制、明確藥物發(fā)揮活性的物質(zhì)基礎(chǔ)、指導(dǎo)臨床合理用藥等方面具有重要意義。鑒于此，本研究采用HPLC- MS/MS 技術(shù)對(duì)糖尿病大鼠模型口服COP 后尿液、糞便、膽汁中藥物原型及代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，為更全面的了解COP的體內(nèi)過(guò)程提供依據(jù)。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

黃連堿（COP，成都曼思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)MUST-12111602，純度≥98%）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，純度≥98%）；烏拉坦（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)M17818018）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum 液質(zhì)聯(lián)用儀，配有大氣壓化學(xué)離子源（APCI）和電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 數(shù)據(jù)系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó)）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL20M 型高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）MTN-2800D 型氮?dú)獯蹈蓛x（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠18 只，體重（200±20）g，購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0004。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，室溫22℃～25℃，濕度50%～65%，光照條件為12 h 明暗交替，喂以SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 色譜－質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)；采用C18保護(hù)柱（10 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（0 ～10 min，30%～70%A；10 ～15 min，70% ～80%A；15 ～20 min，80% ～30%A；20 ～30 min，30%A）。柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10μL，分流比：4∶1；樣品架溫度：4℃[11]。

離子源：電噴霧電離（ESI）；檢測(cè)方式：正離子模式（Positive，Negative）；噴霧電壓：3000 V；干燥氣溫度：350℃；霧化器設(shè)置：206.90 kpa；鞘氣（N2）流速：10.0 L/min；掃描范圍m/z：50 ～700，COP：320 →292；BBR：336 →320。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與樣品前處理

2.2.1 糖尿病大鼠模型的制備[8]

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按40 mg/kg劑量腹腔注射新鮮配置的1%鏈脲佐菌素溶液，1次/d，連續(xù)6 d，大鼠斷尾取血，通過(guò)血糖儀每日監(jiān)測(cè)空腹血糖值，同時(shí)記錄體重，血糖值高于16.7 mmol/L，確定為糖尿病造模成功，否則重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)操作，補(bǔ)注鏈脲佐菌素，重新測(cè)血糖，達(dá)到要求血糖值并穩(wěn)定一段時(shí)間后用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.2 大鼠給藥及體內(nèi)排泄樣品的收集

分別取正常及糖尿病大鼠各3 只，分別置于代謝籠，自由飲食，收集糞便和尿液作為空白樣品；給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠稱重后，按照20 mg/kg劑量口服灌胃給予COP 藥物溶液（精密稱取COP 適量，加入0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液適量，研勻后加入生理鹽水適量，超聲3 min，配成2 g/L 的藥物溶液），之后置于代謝籠，自由飲食，分別收集0～48 h 尿液和糞便樣品。樣品置于-80℃保存。

分別隨機(jī)選取正常及糖尿病大鼠各3只，禁食12 h，自由飲水。灌胃給予生理鹽水后，立即采用腹腔注射25%烏拉坦溶液，麻醉后打開(kāi)大鼠腹腔進(jìn)行膽管插管，收集0 ～36 h膽汁用作空白膽汁樣品。另外，分別隨機(jī)選取正常及糖尿病大鼠各3 只，禁食12 h，自由飲水。按照20 mg/kg 劑量灌胃給予上述COP 藥物溶液后，采用同樣的方法對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，膽管插管，收集0 ～36 h膽汁作為待測(cè)膽汁樣品。樣品置于-80℃保存。

2.2.3 樣品的處理

分別取空白、給藥糞便樣品，稱重，加入約4 倍量甲醇，搗碎勻漿，超聲提取30 min，取勻漿液1 mL，15 000 r/min 離心15 min，取上清液，0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液用于HPLC-MS/MS分析[12]。

分別取空白和給藥尿液和膽汁樣品，加2 倍甲醇混勻，超聲提取20 min，15 000 r/min 離心15 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液用于HPLCMS/MS分析。

3 結(jié)果

在正離子模式下，對(duì)各組處理后的6 個(gè)生物樣品進(jìn)行一級(jí)全掃描（m/z 范圍：50 - 700），對(duì)生物樣品中的原型及代謝物進(jìn)行鑒定。由于藥物在生物體內(nèi)的發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，主要是藥物分子在保留原有基本骨架的基礎(chǔ)上，在酶的作用下發(fā)生的官能團(tuán)的改變，或者在酶的作用下發(fā)生的結(jié)合反應(yīng)，因此，代謝物具有原藥的特征質(zhì)譜裂解碎片或中性丟失。本次實(shí)驗(yàn)在正常和糖尿病大鼠的尿液、糞便、膽汁共發(fā)現(xiàn)14 個(gè)COP代謝產(chǎn)物，通過(guò)HPLC-MS/MS 方法進(jìn)一步分析，COP在糖尿病大鼠與正常大鼠在尿液、糞便和膽汁代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量并無(wú)本質(zhì)的區(qū)別，且分別在尿液、糞便和膽汁中鑒定出10個(gè)、11個(gè)和8個(gè)代謝產(chǎn)物。

將給藥組樣品圖譜與空白組樣品對(duì)比分析，圖1為生物樣品中檢測(cè)到的COP 及其代謝物的MS1和MS2質(zhì)譜圖，表1 為COP 代謝物鑒定結(jié)果。結(jié)合具有相同骨架的生物堿如小檗堿在生物體內(nèi)的代謝規(guī)律和質(zhì)譜裂解規(guī)律[10,13]，分析各代謝產(chǎn)物可能的代謝途徑如圖2所示。

一般在采用HPLC-MS 進(jìn)行代謝研究時(shí)，要注意不同位點(diǎn)可能發(fā)生同一代謝過(guò)程，會(huì)生成多種具有同分異構(gòu)體性質(zhì)的代謝產(chǎn)物，因此不能夠只憑質(zhì)量數(shù)的變化進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，還要根據(jù)代謝過(guò)程的質(zhì)量變化進(jìn)行代謝物篩査和鑒定。關(guān)鍵在于裂解途徑的分析與鑒定以及通過(guò)研究藥物原型及其代謝物的裂解過(guò)程，比較碎片離子和母離子的差異，將有助于代謝物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確鑒定[14-15]。

COP 各代謝物的結(jié)構(gòu)推斷，主要根據(jù)藥物在體內(nèi)代謝規(guī)律以及已報(bào)道的COP 的裂解規(guī)律，還有其他原小檗堿型生物堿代謝特點(diǎn)[16]，再通過(guò)EIC 離子流圖和一級(jí)、二級(jí)碎片離子信息及色譜保留時(shí)間。M0 的m/z為320.09，其子離子m/z 292.03，結(jié)合COP 的質(zhì)譜圖推測(cè)該化合物為COP原型。

多數(shù)藥物經(jīng)過(guò)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，即發(fā)生I相代謝和II相代謝，通過(guò)引入某些基團(tuán)或與內(nèi)源性物質(zhì)共價(jià)鍵結(jié)合生成親水性更強(qiáng)的形式，從而達(dá)到增加藥物親水性的目的，大部分經(jīng)尿液排泄排出體外。代謝反應(yīng)分成兩大類：I相反應(yīng)和II相反應(yīng)。常見(jiàn)的I相反應(yīng)包括氧化、還原、水解等，目的是引入或暴露某些極性官能團(tuán)，如羥基、羧基、氨基和巰基等；II 相反應(yīng)則通過(guò)與內(nèi)源性物質(zhì)經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合，生成極性大、水溶性高的結(jié)合物[17]。

圖1 COP及其代謝物的MS1和MS2質(zhì)譜圖

表1 COP及其代謝產(chǎn)物的[M+]/MS2信息

圖2 COP體內(nèi)的主要代謝途徑（Glu：葡萄糖醛酸）

通過(guò)糖尿病大鼠體內(nèi)COP 生物轉(zhuǎn)化分析研究，以COP 為原型共鑒定出了14 個(gè)代謝產(chǎn)物。“C-O”鍵斷裂后產(chǎn)生的M3（m/z 336.120）和M5（m/z 352.25）分別比其母離子增加了16 和32，推測(cè)是由COP I 相代謝發(fā)生羥基化或兩次羥基化生成的，M3 再發(fā)生葡萄糖醛酸化形成M14（m/z 528.29）。與此類似的變化，還有M9（m/z 340.10）和M11（m/z 356.28），這兩個(gè)代謝產(chǎn)物可能是M0 發(fā)生多次羥基化生成的。COP 原型M0 脫氫后變?yōu)镸1（m/z 318.30），M1 繼續(xù)發(fā)生葡萄糖醛酸化形成為M12（m/z 482.19），M13（m/z 470.32）分子量比M12少12，推測(cè)是M1 發(fā)生葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)后去甲基化的產(chǎn)物，M4（m/z 388.27）比M1 的分子量增加了70，是由M1 發(fā)生硫酸酯化形成的。代謝物M6（m/z 308.09）比COP 原型減少了12，推測(cè)可能是由于形成雙鍵形成的（脫掉次甲基）。COP 原型先加氫還原反應(yīng)后形成了M2（m/z 322.11），M2 的一部分通過(guò)I 相代謝加氫還原形成了M7（m/z 324.29），M2 的另一部分通過(guò)發(fā)生葡萄糖醛酸化形成了M8（m/z 498.29）。M10（m/z 296.18）是由M0去甲基化后加氫還原所得。代謝產(chǎn)物大部分通過(guò)尿液排出體外。COP 的代謝反應(yīng)類型主要是I相代謝（羥基化、氫化、去甲基化和脫氫）和II相代謝（葡萄糖醛酸結(jié)合和硫酸酯化）。推測(cè)主要代謝產(chǎn)物見(jiàn)表1，代謝途徑見(jiàn)圖2。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)正常和糖尿病大鼠生物樣品尿液、糞便、膽汁中COP 及其代謝物的定性分析得出，COP可在大鼠體內(nèi)可發(fā)生較廣泛的Ⅰ相和Ⅱ相代謝，在大鼠尿液、糞便、膽汁共鑒定出14 個(gè)代謝產(chǎn)物，尿液10個(gè)、糞便11 個(gè)、膽汁中8 個(gè)。其中Ⅰ相代謝產(chǎn)物5 個(gè)，主要為羥基化物和去甲基化物；Ⅱ相代謝產(chǎn)物9個(gè)，主要為葡萄糖醛酸化物。

總的來(lái)看，COP 的代謝產(chǎn)物在糖尿病大鼠和正常大鼠的種類是一致的，而且在尿液和糞便樣品中，COP的代謝產(chǎn)物在二者之間的種類也是一致的；但二者膽汁中的代謝產(chǎn)物種類有差異，M4 在糖尿病大鼠膽汁中并未檢出，M4 是代謝產(chǎn)物中唯一的硫酸酯化合物，是由COP 脫氫后生成M1 繼續(xù)發(fā)生硫酸酯化形成的，糖尿病大鼠的膽汁代謝中缺少了COP 脫氫后變成M1的硫酸酯化的過(guò)程，因此在糖尿病大鼠膽汁中COP 脫氫后變成M1 后發(fā)生了其他的代謝反應(yīng)生成了更多的M9、M11、M12、M13。本研究推測(cè)M1 在正常和糖尿病大鼠膽汁的代謝差異可能是COP 產(chǎn)生降糖作用的原因。

4 討論

藥物代謝也稱為生物轉(zhuǎn)化，是指藥物在藥物代謝酶作用下，其化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)發(fā)生改變的過(guò)程。肝臟和胃腸道是藥物代謝的主要場(chǎng)所，多數(shù)藥物進(jìn)入機(jī)體后主要經(jīng)肝臟進(jìn)行代謝，代謝產(chǎn)物由腎臟經(jīng)尿液排出，一些吸收較差的藥物主要由糞便排出。由于藥物的血藥濃度與藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄（ADME）四個(gè)過(guò)程密切相關(guān)，而ADME 各環(huán)節(jié)往往需要體內(nèi)廣泛分布的轉(zhuǎn)運(yùn)體以及代謝酶的參與，因此，轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的功能是影響藥物的生物利用度的重要因素。

通過(guò)研究COP 體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，本研究發(fā)現(xiàn)M0 脫氫生成M1 后，M1 共有5 條代謝途徑，而在糖尿病大鼠膽汁中未檢出M4，即M1 在糖尿病大鼠膽汁中的代謝未發(fā)生硫酸酯化反應(yīng)，只發(fā)生了葡萄糖醛酸化和羥基化反應(yīng)，從而生成了更多的羥基化產(chǎn)物和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。因此，本研究推測(cè)可能是由于在病理狀態(tài)下M1 代謝路徑的差異導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物的量與正常狀態(tài)下不同，從而產(chǎn)生了降糖作用。具體由M1 生成的多個(gè)代謝產(chǎn)物量上的差異，尚需進(jìn)一步的針對(duì)性的研究驗(yàn)證。

對(duì)于代謝物的鑒定，解析質(zhì)譜碎片離子裂解反應(yīng)途徑是推斷代謝過(guò)程的關(guān)鍵。對(duì)于多數(shù)代謝物而言，可用質(zhì)譜方法根據(jù)其MS、MS2 鑒定其結(jié)構(gòu)，但有時(shí)僅憑m/z 不能完全確證，可通過(guò)NMR 等分析手段進(jìn)一步確證。此外在結(jié)構(gòu)鑒定中，代謝物具有較高的相對(duì)濃度和響應(yīng)值是關(guān)鍵。

COP 是黃連中重要的一種生物堿，對(duì)黃連的有效成分在體內(nèi)的代謝過(guò)程進(jìn)一步闡明為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，使黃連資源的研究、開(kāi)發(fā)更全面，逐步走向成熟和規(guī)范化。同時(shí)，注重黃連有效成分藥理活性的研究，充分發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使其更加有效地應(yīng)用于臨床[18]。