孫向明，宋 輝，胡 揚，溫靜，薛 屹，鄒 翔＊＊

（1. 哈爾濱商業(yè)大學藥學院 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學藥物工程技術研究中心 哈爾濱 150076）

中藥吳茱萸具有散寒止痛、疏肝下氣、溫中燥濕的功效，通常被用于治療厥陰頭痛、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、寒濕腳氣、高血壓等疾病，其主要化學成分有生物堿類、黃酮類、三萜類等[1-4]，生物堿類是主要的有效成分，具有抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等生物活性[5-7]。在歷代本草中，吳茱萸被列為中品，記載有毒或有小毒。據(jù)報道，有人因大劑量服用吳茱萸出現(xiàn)頭痛、胸悶、視物模糊、劇烈腹痛等癥狀[8]。已有學者指出，肝臟是其毒性靶器官之一[9]。目前，吳茱萸的肝毒性已引起國內(nèi)外學者的廣泛關注[10-11]，相關的研究陸續(xù)展開。動物研究表明，吳茱萸的水提物、醇提物和揮發(fā)油均可引起肝毒性，并呈一定的“量-時-毒”關系，其中揮發(fā)油的肝毒性作用機制可能與氧化損傷有關[9,12-14]。本課題組前期實驗已證明吳茱萸的50%乙醇提取物具有肝毒性，并采用UPLC-Q-TOF MS 技術對吳茱萸的50%乙醇提取物化學成分及血中移行成分進行了結構表征[15]，通過譜效相關性研究發(fā)現(xiàn)以吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿為代表的喹諾酮類生物堿是其潛在的肝毒性成分[16]。而吳茱萸中喹諾酮類生物堿同時也具有抗菌消炎等作用，既是有毒成分也是有效成分。為了臨床合理的應用吳茱萸及適當?shù)亩拘灶A警，本研究在前期研究成果的基礎上，采用UPLC-TQD-MS/MS 技術，針對已篩選出的兩種吳茱萸肝毒性成分（吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿）進行大鼠口服吳茱萸肝毒性部位后的代謝動力學研究，旨在分析毒性劑量下，兩種肝毒性成分的體內(nèi)作用規(guī)律，表征吳茱萸肝毒性成分的動力學特征，為指導吳茱萸的臨床合理、安全使用提供科學依據(jù)。

1 材料

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜與Xevo TQD 三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Waters 公司產(chǎn)品；GENIUS N118LA 氮氣發(fā)生器：英國PEAK 公司產(chǎn)品；Allegra 64R 低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾有限公司產(chǎn)品。

吳茱萸藥材：購自哈爾濱三棵樹藥材市場，由哈爾濱商業(yè)大學藥學院曲中原教授鑒定為吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth；吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿對照品（上海依赫生物科技有限公司，純度＞98%，批號YH-201604）；內(nèi)標地西泮（上海依赫生物科技有限公司，純度> 98%，批號YH-201605）；甲醇（德國賽默飛世爾公司，質(zhì)譜純，批號：20160311）；乙腈（德國賽默飛世爾公司，質(zhì)譜純，批號20160410）；純凈水（屈臣氏，批號20161205）；甲酸（色譜純，上?？其J實業(yè)有限公司，批號20160509）。

SPF 級雄性Wistar 大鼠體重（220 ± 20）g，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，許可證號：SCXK-（黑）2013-001。

2 方法

2.1 灌胃藥液的制備

采用參考文獻[16]“1.2.1”項下方法制備大鼠的灌胃藥液。

2.2 給藥方案和血漿樣品的采集

取雄性大鼠8 只，給藥前稱重，按照25 g·kg-1·d-1（以生藥計）的劑量灌胃給藥，灌胃體積為25 mL·kg-1，每天一次，連續(xù)給藥14 d。最后一次給藥前禁食不禁水12 h，于 給 藥 后5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h由大鼠眼眶靜脈叢取血約0.3 mL 至肝素化的1.5 mL EP 管中，5000 r·min-1離心10 min，分離上層血漿，于-20℃冰箱中保存待測。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7 μm,2.1 × 100 mm）；保護柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7μm,2.1×5 mm）；柱溫：40℃；流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（75∶25）；流速：0.25 mL/min；進樣量：5μL。

表1 待測成分的定量離子對和參數(shù)設置

2.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧正離子模式（ESI+）；毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：55 V；源溫度：350℃；霧化氣溫度：50℃；霧化氣流速：650 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；采用多反應監(jiān)測模式（MRM）掃描，待測成分的定量離子對及參數(shù)設置，見表1。

2.5 溶液的配制

2.5.1 系列混合標準溶液的配制

精密稱取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿標準品適量，80%甲醇稀釋成濃度為5μg/mL 的儲備液備用，分別精密吸取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿儲備液適量，用80%甲醇定量稀釋成濃度為1 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2500 ng/mL的系列標準溶液，置冰箱4 ℃冷藏，備用。

2.5.2 質(zhì)控標準溶液的配制

精密吸取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿儲備液適量，用80%甲醇定量稀釋成濃度分別為1 ng/mL、5 ng/mL、200 ng/mL、2000 ng/mL 的定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控標準溶液，置冰箱4℃冷藏，備用。

2.5.3 內(nèi)標溶液的配制

精密稱取地西泮適量，加適量甲醇溶解并稀釋，配制成濃度為200 ng/mL 的內(nèi)標儲備液，置冰箱4℃冷藏，備用。

2.6 血漿樣品預處理方法的考察

分別采用乙酸乙酯萃取法[17]、二氯甲烷萃取法、甲醇沉淀蛋白法進行血漿樣品的預處理，比較不同預處理方法對吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿提取回收率的影響。

（1）取10μL混標（500 ng/mL），40℃下氮氣吹干溶劑，精密加入空白血漿100 μL，制得含混標50 ng/mL的血漿樣本，加入10 μL 內(nèi)標溶液，渦旋混合30 s，分別加入乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇各660μL，渦旋混合3 min，14000 r·min-1低溫高速離心10 min，分別取乙酸乙酯和甲醇的上清液，取二氯甲烷的下層清液在40℃下氮氣吹干。測定前向殘渣中加入100μL 80%甲醇復溶，渦旋1 min，14000 r·min-1低溫高速離心20 min，取上清進樣分析。記錄待測成分與內(nèi)標的峰面積，計算二者峰面積之比，記為A。

（2）取10μL 內(nèi)標液，40 ℃下氮氣下吹干甲醇，精密加入100 μL 空白血漿，渦旋混合30 s，分別加入乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇各660 μL，渦旋混合3 min，14000 r·min-1低溫高速離心10 min，分別取乙酸乙酯和甲醇的上清液，取二氯甲烷的下層清液在40 ℃下氮氣吹干。再向殘渣中加入100 μL 混合標準品溶液（50 ng/mL），渦旋混勻1 min，14000 r·min-1低溫高速離心20 min，取上清進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標的峰面積，計算二者峰面積之比，記為B。以A/B 計算提取回收率。

2.7 方法學驗證

2.7.1 方法專屬性試驗

精密移取大鼠空白血漿100μL，按“2.6”（1）項下篩選得到的血漿預處理方法操作（不加混標和內(nèi)標溶液），得空白血漿樣品的色譜圖；以篩選得到的血漿預處理方法按照“2.6”（1）項下的操作步驟操作，得模擬血漿樣品色譜圖；取大鼠灌胃給藥0.5 h 后的血漿樣品，加入內(nèi)標溶液10μL，其余步驟按“2.6”（1）項下篩選得到的方法操作，得給藥后血漿樣品色譜圖。對比上述色譜圖，觀察內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物是否干擾血漿中吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿、地西泮的測定。

2.7.2 線性關系考察與定量下限

精密移取系列混合標準溶液10 μL，40 ℃下氮氣吹干溶劑，精密加入大鼠空白血漿100 μL，制成相當于吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿0.1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL的模擬血漿標準樣品，加入10 μL 內(nèi)標溶液，渦旋混合30 s，其余按“2.6”（1）項下篩選得到的方法操作，進行UPLC-MS/MS 分析，記錄待測成分及內(nèi)標的峰面積，每一個濃度的標準品溶液分析三個樣本。以待測成分濃度（ng/mL）為橫坐標X，待測成分與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標Y，繪制標準曲線，采用加權（w = 1/x2）最小二乘法進行回歸運算，得到回歸方程。以樣品峰與基線的信噪比S/N = 10 時的樣品濃度為定量下限（LOQ）。

2.7.3 準確度與精密度考察

精密移取質(zhì)控標準溶液10 μL，40℃下氮氣吹干溶劑，精密加入100 μL 大鼠空白血漿，加入10 μL 內(nèi)標溶液，渦旋混合30 s，其余按“2.6”（1）項下篩選得到的方法操作，得定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控樣品，濃度分別為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、20 ng/mL、200 ng/mL。每一濃度樣品平行制備6 份并進行測定，分別計算日內(nèi)與日間的準確度、精密度。

2.7.4 基質(zhì)效應與提取回收率

精密吸取低、中、高濃度的質(zhì)控標準溶液10 μL，分別加入內(nèi)標液10μL，以80%甲醇稀釋至100μL，混勻后進樣分析，記錄待測成分與內(nèi)標的峰面積，二者峰面積比計為Al；取100 μL 大鼠空白血漿，按“2.6”（1）項下篩選得到的方法加入內(nèi)標之后的步驟處理，測定前加入內(nèi)標液10μL和低、中、高濃度的質(zhì)控標準溶液10μL，以80%甲醇稀釋至100μL，混勻后進樣分析，每個濃度測定6份樣品，記錄待測成分與內(nèi)標的峰面積，計算二者峰面積之比計為A2，以A2/A1計算基質(zhì)效應。

取低、中、高濃度的質(zhì)控標準溶液各6 份，每份10μL，加入10μL 內(nèi)標液，氮氣吹干溶劑，分別加入空白血漿100μL，按“2.6”（1）項下篩選得到的方法加入內(nèi)標之后的步驟處理，進樣分析，測定待測成分與內(nèi)標的峰面積，二者峰面積比計為A3，以A3/A2計算回收率。

2.7.5 穩(wěn)定性考察

室溫穩(wěn)定性考察：分別取大鼠空白血漿100 μL，分別加入內(nèi)標液10μL和低、中、高濃度的質(zhì)控標準溶液10μL，按“2.6”（1）項下篩選得到的方法加入內(nèi)標之后的步驟處理，室溫放置6 h，每一濃度進行6 樣本分析，考察血漿樣品室溫放置6 h的穩(wěn)定性。

冷凍穩(wěn)定性考察：取低、中、高三個濃度質(zhì)控標準溶液，每一濃度平行制備6 份，-20℃凍存7 d，考察血漿樣品凍存7 d的穩(wěn)定性。

三次凍融穩(wěn)定性考察：取低、中、高三個濃度的質(zhì)控標準溶液，每一濃度平行制備6 份，-20℃存放24 h，取出至室溫放置使自然解凍，當溶解完全后，取樣進行分析，然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持24 h 以上，如此解凍-冷凍重復循環(huán)三次，考察血漿樣品反復凍融三次后的穩(wěn)定性。

表2 不同預處理方法提取回收率結果（±s，n = 3）

表2 不同預處理方法提取回收率結果（±s，n = 3）

處理方法乙酸乙酯萃取法二氯甲烷萃取法甲醇沉淀蛋白法提取回收率/%吳茱萸新堿91.78±4.32 79.63±5.87 58.81±7.24二氫吳茱萸新堿92.43±3.15 75.92±4.06 62.59±6.59

2.8 樣品的測定及數(shù)據(jù)分析

將采集的大鼠血漿樣品按“2.6”項下篩選出的血漿樣品的預處理方法處理后，進行UPLC-MS/MS 分析測定。采用PK Solver 2.0 軟件非房室模型法進行分析，并進行相應參數(shù)的估算。

3 結果

3.1 血漿樣品預處理方法的考察

實驗比較了乙酸乙酯萃取法、二氯甲烷萃取法、甲醇沉淀蛋白法對血漿樣品的預處理情況。三種方法對吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿提取回收率結果見表2。

研究結果表明，采用乙酸乙酯為萃取溶劑時，吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的回收率均在90%以上，顯著高于二氯甲烷萃取法和甲醇沉淀蛋白法，故選取乙酸乙酯萃取法作為本實驗中血漿樣品的預處理方法。

3.2 分析方法學考察

3.2.1 方法專屬性

在上述試驗條件下，可見各待測成分離子化后產(chǎn)生的準分子離子峰[M+H]+，在2.379 min 時可見吳茱萸新堿的m/z 340.26 峰，在3.459 min 時可見二氫吳茱萸新堿的m/z 342.27 峰，在1.316 min 時可見內(nèi)標地西泮的m/z 285.08 峰，各成分的質(zhì)譜圖和化學結構，如圖1所示。圖2 進一步比較了空白血漿樣品、加入標準品和內(nèi)標的模擬血漿樣品以及給藥0.5 h 后的血漿樣品中吳茱萸新堿（WZYXJ）二氫吳茱萸新堿（EQWZYXJ）、地西泮（DXP）的多反應監(jiān)測（MRM）離子色譜圖。

結果表明：在實驗所采用的色譜和質(zhì)譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物對吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿、地西泮的測定無干擾，方法專屬性良好。

3.2.2 標準曲線與定量限

測定血漿中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的標準曲線回歸方程、相關系數(shù)r以及定量下限見表3。

研究結果表明：血漿中兩種成分在0.1 ～250 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)r 都大于0.99，符合2015 版藥典關于生物樣品測定的要求。吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿定量下限在0.1 ng/mL 可被有效檢測。

3.2.3 準確度與精密度考察

按“2.7.3”項下操作，定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間準確度、精密度結果見表4。

結果顯示：兩種成分的日內(nèi)和日間準確度均在標示值的± 15%之內(nèi)，精密度的RSD 值均小于15%，表明方法準確度和儀器精密度良好，方法穩(wěn)定可行。

3.2.4 基質(zhì)效應與提取回收率

吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的基質(zhì)效應與提取回收率，如表5、表6所示，兩種成分的基質(zhì)效應和提取回收率均在80%～120%之間。

結果表明：本實驗所采用的方法提取回收率較高，并且沒有明顯的基質(zhì)效應，符合生物樣品的分析要求。

3.2.5 穩(wěn)定性考察

低、中、高三個濃度（0.5 ng/mL、20 ng/mL、200 ng/mL）的質(zhì)控標準溶液在不同條件下的穩(wěn)定性結果見表7。

結果顯示，將血漿樣品室溫放置6 h，-20℃冷凍7 d，三次凍融操作后吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿實測濃度的RSD 值均小于10%，表明兩種成分在上述環(huán)境下的穩(wěn)定性良好，應盡量減少凍融次數(shù)。

3.3 樣品的測定及數(shù)據(jù)分析

采用已建立的UPLC-TQD-MS/MS 方法，測定各采血時間點的血藥濃度，得到兩種成分在大鼠血漿中的藥時曲線（見圖3）和主要的代謝動力學參數(shù)（見表8）。

結果表明：給大鼠灌胃吳茱萸50%乙醇提取物后，吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿在體內(nèi)被迅速吸收，血漿中的平均達峰時間分別為0.54±0.10 h、0.58±0.13 h，平均峰濃度分別為36.38±9.89 ng/mL、22.07±8.34 ng/mL，藥時曲線下面積分別為119.8±29.8 ng/mL、67.25±21.12 ng/mL·h，平均滯留時間為4.68±0.98 h、4.80 ± 1.02 h，表 觀 分 布 容 積 分 別 為0.313 L/kg、0.682 L/kg。二者的清除率分別為0.078 L/h/kg、0.136 L/h/kg，半 衰 期 分 別 為2.80 ± 0.61 h 和3.49 ±0.74 h，經(jīng)過約4個半衰期，血中殘留量大幅降低，說明在體內(nèi)蓄積不明顯。

圖1 吳茱萸新堿（a）、二氫吳茱萸新堿（b）和地西泮（c）的質(zhì)譜圖及化學結構圖

4 討論

有關吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿藥代動力學的研究報道較少，毒代動力學研究尚未見報道。1991年日本的Kano Y 等[18]在文獻中稱，靜脈注射吳茱萸新堿后，其藥代動力學呈單室模型。劑量在75 mg/kg時，吳茱萸新堿在血漿中可線性消除。吳茱萸新堿的總血漿清除率、分布容積和半衰期分別為60 mL/min/kg、3.2 L/kg 和0.6 h。在本研究中，為完全的考察在致肝毒性劑量下，吳茱萸中的兩種潛在肝毒性成分吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的藥動學特征，連續(xù)給大鼠灌胃吳茱萸50%乙醇提取物14 d 后，監(jiān)測不同時間點大鼠血漿中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的含量，采用PK Solver 軟件計算兩種成分的代謝動力學統(tǒng)計矩參數(shù)。結果表明，吳茱萸新堿的各參數(shù)與文獻中靜脈注射吳茱萸新堿單體的參數(shù)差距較大，提示不同給藥方式及給藥劑量，該成分的藥動學性質(zhì)發(fā)生了改變。

一般情況下，藥物的達峰時間越短，吸收速度越快，則其峰濃度越高，毒性也越大。從藥動學數(shù)據(jù)來看，兩個目標化合物的藥動學參數(shù)比較接近，吸收均較快，在給藥后的30 min左右達到最大血藥濃度，平均峰濃度分別為36.38±9.89 ng/mL、22.07±8.34 ng/mL，相對于給藥劑量而言并不低，符合對吳茱萸為小毒中藥的描述。二者的半衰期比較接近，在2.80 ～3.49 h范圍內(nèi)，說明兩個成分的整體藥代謝動力學行為相近，初步反映了吳茱萸肝毒性成分在大鼠體內(nèi)的作用過程。表觀分布容積和血漿清除率可評價重復給藥其毒性在機體內(nèi)是否有蓄積性，表觀分布容積越小，血漿清除率越高，說明藥物排泄越快，在體內(nèi)滯留時間越短。吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的表觀分布容積分別為0.313 L/kg、0.682 L/kg，清除率分別為0.078 L/h/kg、0.136 L/h/kg，可以認為在其14 d 的給藥期內(nèi)，大鼠血液中并無明顯的蓄積情況發(fā)生。

圖2 空白血漿樣品（a）、模擬血漿樣品（b）和給予吳茱萸肝毒性部位0.5 h后的血漿樣品（c）MRM離子色譜圖

表3 兩種成分的回歸方程、相關系數(shù)r及定量下限

表4 QC樣品的準確度、精密度測定結果（n = 6）

表5 吳茱萸新堿的基質(zhì)效應和提取回收率（n = 6）

表6 二氫吳茱萸新堿的基質(zhì)效應和提取回收率（n = 6）

表7 質(zhì)控標準溶液穩(wěn)定性測定結果（±s，n = 6）

表7 質(zhì)控標準溶液穩(wěn)定性測定結果（±s，n = 6）

條件室溫6 h冷凍7 d凍融循環(huán)3次濃度/（ng?mL-1）0.5 20 200 0.5 20 200 0.5 20 200吳茱萸新堿實測濃度（ng?mL-1）0.49±0.03 19.87±0.48 197.96±1.88 0.50±0.02 19.85±0.64 199.23±2.45 0.47±0.03 19.16±1.50 197.93±3.05 RSD/%6.12 2.42 0.95 4.01 3.22 1.23 6.38 7.83 1.54二氫吳茱萸新堿實測濃度（ng?mL-1）0.49±0.02 19.80±0.65 198.02±2.43 0.48±0.02 19.49±0.62 199.45±1.31 0.47±0.02 18.97±1.82 196.34±5.11 RSD/%4.07 3.28 1.23 5.00 3.18 0.66 4.26 9.59 2.60

圖3 口服吳茱萸肝毒性部位后大鼠體內(nèi)的吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿藥時曲線（±s，n=8）

表8 吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿的代謝動力學參數(shù)±s，n = 8）

表8 吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿的代謝動力學參數(shù)±s，n = 8）

參數(shù)t1/2（h）Tmax（h）Cmax（ng/mL）AUC 0-t（ng/mL·h）AUC 0-∞（ng/mL·h）MRT(0-∞)（h）Vz/F（L/kg）Clz/F（L/h/kg）吳茱萸新堿2.80±0.61 0.54±0.10 36.38±9.89 119.8±29.8 128.2±27.6 4.68±0.98 0.313 0.078二氫吳茱萸新堿3.49±0.74 0.58±0.13 22.07±8.34 67.25±21.12 73.73±23.79 4.80±1.02 0.682 0.136

5 結論

本課題組研究了大鼠口服吳茱萸致肝毒性后，兩種喹諾酮類生物堿吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿在大鼠體內(nèi)的代謝動力學行為。首次建立了一個快速、準確、靈敏的UPLC-TQD/MS 分析方法，用以同時測定大鼠血漿中的吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿，并進行了方法學驗證。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物對這兩種成分及內(nèi)標的測定無干擾，且分析方法快速、靈敏，適用于血液生物樣品中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的測定。目標成分的藥動學參數(shù)提示其具有一定的毒性，但并未在體內(nèi)發(fā)生蓄積。