嚴(yán) 莉，郭 珮，周 航，夏宛廷，黃金珠，曾鵬飛，曾 倩

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 成都 610072）

不孕癥是婦科常見疑難雜病，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精、主生殖，“胞絡(luò)者系于腎”“男精壯”“女經(jīng)調(diào)”“氤氳時”“陰陽和”是孕育的基礎(chǔ)。在總結(jié)前人經(jīng)驗后，《石室秘錄·子嗣論》提出“女子不能生子有十病”，其中“胞宮寒”是首病?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床研究表明，“腎虛血瘀”是目前女性不孕的主要癥型[1]?，F(xiàn)代生殖醫(yī)學(xué)認(rèn)為，種植窗期是子宮內(nèi)膜允許胚胎著床的關(guān)鍵時期，胚胎植入過程伴隨子宮組織生成豐富的血管[2]，為胚胎附著和著床提供了必要的物質(zhì)，是確保胚胎種植成功的關(guān)鍵[3-5]。而血管生成是通過體內(nèi)存在諸多互補(bǔ)和復(fù)雜的信號途徑調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、血管生成素（Ang）-Tie2 軸和Notch 信號通路在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，血管生成調(diào)控因子Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 在種植窗期子宮組織及早期胎盤中出現(xiàn)高表達(dá)[6-7]。亦有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜局部炎性反應(yīng)有助于改善妊娠結(jié)局[8]，這可能與炎癥調(diào)節(jié)血管生成有關(guān)[9]。因此，研究中藥對種植窗期子宮組織血管生成的影響對闡釋中藥的助孕機(jī)制具有重要意義。

本課題組結(jié)合導(dǎo)法（直腸灌注）給藥能更接近“胞宮”，并能溫通血脈和直接物理暖宮的特點，運用補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法治療腎虛血瘀型女性不孕癥患者，能提高臨床自然妊娠率[10]。前期研究已表明，補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法治療可提高腎虛血瘀型大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜組織的血液灌注[11]。本研究采用大鼠腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結(jié)合模型，從種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)特征、螺旋動脈數(shù)量和血管生成相關(guān)因子的表達(dá)情況等方面，研究補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法給藥治療不孕癥，調(diào)控種植窗期子宮組織血管生成的助孕機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級健康成年雌性未孕SD 大鼠70 只，體重220±20 g，從中篩選動情周期規(guī)律的雌性大鼠60 只，SPF 級健康成年雄性SD 大鼠20 只，體重250±20 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供（合格證號：SCXK（川）2015-030），于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑病證實驗室動物房飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

補(bǔ)腎活血方（原助孕Ⅰ號方）由大菟絲子、枸杞子、覆盆子、續(xù)斷、絲瓜絡(luò)、山楂、丹參和山藥八味藥組成。此方由四川省第三批名中醫(yī)提供，專利名稱：一種治療或輔助治療不孕癥的藥物組合物及其制備方法和用途，專利號：ZL201410390113.7；由四川省中醫(yī)院中藥制劑室提供，規(guī)格：50 mL/瓶，生產(chǎn)日期：20180811，成人日用量：0.73 g生藥/kg。阿司匹林腸溶片：拜阿司匹林公司，規(guī)格：100 mg/片，生產(chǎn)批號：BJ38807，國準(zhǔn)字號：J20171021，成人日用量：1.07 mg/Kg。羥基脲片：齊魯制藥有限公司，規(guī)格：500 mg/片，生產(chǎn)批號：8CO133D05，國準(zhǔn)字號：H37021289。鹽酸腎上腺素注射液：天津金藥藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL/支，生產(chǎn)批號：1710201，國準(zhǔn)字號：H12020526。米非司酮片，華潤紫竹藥業(yè)有限公司，規(guī)格：25 mg/片，生產(chǎn)批號：431706061，國準(zhǔn)字號：H10950003。

1.3 主要試劑

VEGF 兔抗鼠一抗（博士德生物公司，BA0407）、山羊抗小鼠熒光二抗（美國Abbkine 公司，A23227，A23210）、VEGF、FLK-1 ELISA 試劑盒（SHANGHAI WESTANG BIO-TECH CO.,LTD，批號分別為F17120、F17121）、PCR 引物（tsingke 公司）、Anti-Ang1 抗體（abcam 公司，ab102015）、Anti-Ang2抗體（abcam 公司，ab155106）、羊兔抗HRP（Jackson ImmunoResearch 公司 ，111-035-003）、Anti-TIE2（abcam 公 司 ，ab227219）、Trizol 試 劑（Invitrogen 公 司，182808）、SYBRGreenPCR試劑盒（Roche公司，1803058）。

2 方法

2.1 藥物制備

阿司匹林用蒸餾水配制成濃度為1.35 mg/mL 的藥液，6.75 mg/Kg·d。羥基脲用蒸餾水配制成濃度為96 mg/mL 的藥液，450 mg/Kg·d。米非司酮用蒸餾水配制成濃度為2.2 mg/mL的藥液，5.5 mg/Kg·只。

2.2 腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結(jié)合模型建立

參照齊寧等[12]建立的大鼠胚泡著床障礙動物模型、馮倩怡等[13]建立的腎虛血瘀-子宮內(nèi)膜容受性不良模型及田瀅舟等[14]建立的腎虛胚胎著床障礙小鼠病證結(jié)合模型，建立腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結(jié)合模型。除空白組，其余每組均予羥基脲450 mg/(kg·d)灌胃，每日一次，連續(xù)10 天，于第4 天開始加用腎上腺素0.3 mg/(kg·d)皮下注射7天造成腎虛血瘀模型；空白組予等量生理鹽水灌胃10 天，第4 天開始加用等量生理鹽水皮下注射7 天。于第11 天起，陰道涂片篩查各組動情期大鼠，每晚18:00按雌雄2∶1合籠，第二天早上7:00 觀察陰栓或行陰道涂片觀察精子，發(fā)現(xiàn)陰栓或精蟲者為妊娠第1 天；除空白組其余各組均于妊娠第4天頭頸部皮下注射米非司酮溶劑，5.5 mg/kg，造成著床障礙性不孕癥模型，空白組則予等量芝麻油溶劑注射。

2.3 分組與給藥

連續(xù)2 個動情周期陰道涂片觀察，篩選動情周期規(guī)律的大鼠60 只，動情前期時入組，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、對照組及補(bǔ)腎活血方高、低劑量組（分別簡稱“高劑量組”“低劑量組”），每組各12 只，于造模第1 天開始，每日10:00，低劑量組、高劑量組分別予補(bǔ)腎活血方濃縮液4.6 g/kg、9.2 g/kg灌腸，連續(xù)10天；空白組、模型組分別予生理鹽水5 mL/kg 灌腸，連續(xù)10 天；對照組則于每日10:00 予阿司匹林腸溶片6.75 mg/Kg·d灌胃，連續(xù)10天。

2.4 處理及標(biāo)本采集

于妊娠第5 天早上8：00，每組隨機(jī)取6 只，予1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉后固定，剖腹行腹主動脈采血5 mL，采血后快速取出雙側(cè)子宮，分離周圍脂肪組織，電子分析天平稱量并記錄各組大鼠子宮、卵巢濕重，計算各組大鼠子宮臟器指數(shù)。取同側(cè)同部位1/4子宮放入EP管，4%多聚甲醛固定，4℃保存，用于光鏡下觀察；取同側(cè)同部位1/4 子宮放入EP 管，4%多聚甲醛固定，用于切片觀察和免疫組化法檢測；取同側(cè)同部位1/4 子宮放入RNA later 保存液中，-80℃保存，用于Real-Time PCR 檢測；取同側(cè)同部位1/4子宮直接放入凍存管，-80℃保存，用于Western-Blot 檢測。所有器械都經(jīng)DEPC水清洗后再使用。

2.5 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠血漿VEGF、FLK-1表達(dá)水平

制備標(biāo)準(zhǔn)溶液：取8個1.5 mL離心管，第一管加標(biāo)本稀釋液900μL，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500μL。在第一管中加入10μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μL置于漩渦混合器上混勻后用加樣器吸出500μL，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500μL 棄去。第八管為空白對照。用1∶20 雙蒸水稀釋，100μL 待測血漿加入每孔，混勻，37℃40 min，洗滌4-6 次，濾紙上干燥，除空白每孔添加50μL 雙蒸水和一抗，混勻，37℃20 min，洗板，添加100 μL 酶標(biāo)抗體，37℃10 min，洗板，加入100 μL 底物工作液，暗光中37℃15 min，添加100μL 停止溶液混勻，并在30 分鐘內(nèi)用微板讀數(shù)儀測量450 nm 處的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品1000 ng/mL、500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.2 ng/mL、15.6 ng/mL、0 ng/mL 為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，使用軟件作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值計算出相應(yīng)VEGF、FLK-1含量。

2.6 采用免疫組化法（IHC）檢測大鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)水平及螺旋動脈數(shù)量

將1/4 大鼠子宮置于4%多聚甲醛固定48 小時后取出，逐級酒精脫水，經(jīng)二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋后切片，將白片在60℃烤箱內(nèi)烤4-6 h，37℃孵箱過夜，二甲苯脫蠟2 次，每次10 min，酒精梯度復(fù)水，每次3 min，去離子水震蕩洗滌2 次，每次5 min，抗原修復(fù)，室溫冷卻，3%H2O2 室溫避光浸泡10 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；滴加封閉血清，室溫孵育15 min，滴加一抗，4℃過夜；復(fù)溫15 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；滴加二抗，常溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗，常溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯2次，每次10 min，中性樹膠封片，檢測VEGF的表達(dá)水平。

表1 Ang-1、Ang-2、Tie-2基因引物序列

2.7 Real-Time PCR 檢 測 大 鼠 子 宮Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)水平

組織冰上解凍后，倒出保存液，在EP 管中加入1 mL Trizol 提取子宮組織中DNA，并進(jìn)行核酸品質(zhì)確認(rèn)，反轉(zhuǎn)錄，加入90 μL RNAfree 水稀釋，加入相應(yīng)引物，用GAPDH 作內(nèi)參，退火溫度54℃。擴(kuò)增條件：94℃變性3 min，30 個循環(huán)；72℃延伸10 min。SYBR green 法檢測Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA 表達(dá)水平。引物序列參見表1。

2.8 Western-Blot 檢測大鼠子宮Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達(dá)水平

子宮組織勻漿后加入適量RIPA 裂解液，制備蛋白并測定蛋白含量，配膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗、二抗，用ECL 法顯色，覆蓋在PVDF 膜反應(yīng)1min，保鮮膜包裹，去殘液，放入X 光片夾曝光、顯影定影。掃描圖像，使用Image-J 圖像分析軟件條帶積分值，檢測大鼠子宮Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One.Way ANOVA）。方差齊，采用單因素方差分析中的LSD（Least-significant diffrerence）方法進(jìn)行多重比較檢驗；方差不齊，采用Tamhane' S T2進(jìn)行多重較檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化（HE×200）

3 結(jié)果

3.1 腎虛血瘀-胚胎著床障礙病證結(jié)合模型大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化

模型組大鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育較差，螺旋動脈少，位于基層，內(nèi)膜腺體小而直，細(xì)胞呈梭形，部分間質(zhì)致密，呈增生期改變；部分間質(zhì)疏松、水腫，呈分泌期改變，間質(zhì)發(fā)育不同步（見圖1-A）。空白組、阿司匹林組與給藥組大鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育較好，螺旋小動脈增生，接近功能層，腺體數(shù)量多，分布均勻，腺體彎曲，腺上皮多呈單層高柱狀上皮細(xì)胞，并夾雜有透亮細(xì)胞，少數(shù)出現(xiàn)頂漿分泌，腺腔明顯增大，內(nèi)有分泌物，間質(zhì)疏松水腫，部分間質(zhì)中見梭形細(xì)胞（見圖1-B，圖1-C，圖1-D，圖1-E，圖1-F）。表明補(bǔ)腎活血方能改善模型大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)，使內(nèi)膜增厚且松軟，利于胚胎著床。

3.2 補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法對模型大鼠種植窗期子宮組織VEGF、FLK-1的表達(dá)影響

各組大鼠子宮內(nèi)膜經(jīng)IHC 染色后，200 倍光鏡下觀察VEGF 的表達(dá)情況，陽性染色為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒狀或細(xì)絲狀。由圖2可見，VEGF在各組大鼠子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)均有表達(dá)，模型組大鼠VEGF 表達(dá)呈黃色、淺黃色，分布稀疏，面積較?。ㄒ妶D2-A）；空白組大鼠VEGF表達(dá)呈棕黃色、黃色，分布密集，面積較廣（見圖2-B）；給藥組及阿司匹林組較模型組VEGF 表達(dá)均有不同程度增加，呈棕黃色、黃色，分布較密集，面積較廣（見圖2-C，圖2-D，圖2-E）。表明補(bǔ)腎活血方能促進(jìn)模型大鼠子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)。

由表2 可見，模型組大鼠子宮內(nèi)膜VEGF、FLK-1表達(dá)量較空白組明顯降低（P < 0.05），螺旋動脈數(shù)量也顯著降低（P < 0.01）；給藥高劑量組大鼠VEGF、FLK-1 表達(dá)量和螺旋動脈數(shù)量均顯著高于模型組（P < 0.01）；給藥低劑量組大鼠螺旋動脈數(shù)量較模型組顯著升高（P<0.01），VEGF、FLK-1表達(dá)量也高于模型組。結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方高劑量給藥能提高模型大鼠血漿中VEGF、FLK-1 表達(dá)水平及促進(jìn)子宮內(nèi)膜螺旋動脈增生，而低劑量組血漿中VEGF、FLK-1 表達(dá)量升高未見統(tǒng)計學(xué)差異，推測可能與其血藥濃度有關(guān)。

3.3 補(bǔ)腎活血導(dǎo)法對各組大鼠子宮濕重及臟器指數(shù)的影響

由表3 可知，模型組大鼠子宮濕重和子宮臟器指數(shù)均較空白組低（P<0.05）；給藥高劑量組、低劑量組和阿司匹林組大鼠子宮濕重及子宮臟器指數(shù)均高于模型組（P < 0.05），且給藥高劑量組與空白組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05）。研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法給藥可增加模型大鼠子宮濕重及子宮臟器指數(shù)，具有修復(fù)子宮受損的作用。

圖2 各組大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)變化（VEGF染色×200）

表2 補(bǔ)腎活血導(dǎo)法對各組別VEGF表達(dá)及螺旋動脈數(shù)量變化（±s）

表2 補(bǔ)腎活血導(dǎo)法對各組別VEGF表達(dá)及螺旋動脈數(shù)量變化（±s）

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

螺旋動脈數(shù)量74.33±20.12**139±25.42##模型組空白組等量生理鹽水等量生理鹽水6 6 369.9±38.77*503.55±100.94#448.64±143.70*635.99±116.07#128.33±25.37##163.83±20.90##135.33±12.72##組別低劑量組高劑量組阿司匹林組劑量7.3 g/Kg 14.6 g/Kg 6.75 mg/Kg n 6 6 6 VEGF（pg/ml）487.37±131.70 583.43±140.12##586.46±58.11##FLK-1（pg/ml）484.34±167.52 691.71±146.24##639.67±119.67#

表3 各組大鼠子宮濕重及臟器指數(shù)

3.4 補(bǔ)腎活血導(dǎo)法對各組大鼠子宮組織Ang-1、Ang-2、Tie-2的蛋白表達(dá)影響

由圖3、表4可見，模型組與空白組比較，大鼠Tie-2 表達(dá)顯著降低（P < 0.01）；給藥低劑量組Tie-2 表達(dá)較模型組高（P < 0.05）；給藥高劑量組和阿司匹林組大鼠Ang-1、Tie-2 表達(dá)量較模型組均顯著升高（P <0.01）；Ang-2 表達(dá)在各實驗組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但給藥組有增高的趨勢。研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方主要影響大鼠子宮Ang-1、Tie-2 蛋白表達(dá)，并能提高模型大鼠子宮組織Ang-1、Tie-2蛋白表達(dá)水平。

表4 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達(dá)水平（±s）

表4 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2蛋白相對表達(dá)水平（±s）

注：與空白組比較：*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組比較：#表示P<0.05，##表示P<0.01

組別模型組空白組低劑量組高劑量組阿司匹林組n 6 6 6 6 6蛋白相對表達(dá)水平Ang-1 0.36±0.13 1.08±0.42 0.63±0.46 0.98±0.23##0.79±0.05##Ang-2 0.73±0.21 0.79±0.20 0.74±0.11 0.91±0.12 0.81±0.26 Tie-2 0.36±0.12**0.74±0.15##0.59±0.10#0.66±0.14##0.65±0.18##

3.5 補(bǔ)腎活血導(dǎo)法對各組大鼠子宮組織Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA的表達(dá)影響

圖3 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2 Western Blot分析結(jié)果

圖4 Ang-1、Ang-2、Tie-2熒光定量PCR擴(kuò)增曲線、溶解曲線圖

圖5 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)

由圖4、圖5 和表5 可見，模型組大鼠Ang-1、Tie-2 mRNA 表達(dá)水平均較空白組顯著降低（P < 0.01），Ang-2 mRNA 表達(dá)也較高（P < 0.05）；給藥高、低劑量組和阿司匹林組大鼠Ang-1、Tie-2 mRNA 表達(dá)水平較模型組均顯著升高（P < 0.01），且給藥高劑量組Ang-1、Tie-2 mRNA 表達(dá)水平與空白組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05）。研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方能提高模型大鼠子宮組織Ang-1、Tie-2 mRNA表達(dá)水平。

3.6 Ang/Tie-2 通路與VEGF、螺旋動脈數(shù)量相關(guān)性分析

從表6 可見，Ang-1、Tie-2 表達(dá)與VEGF 表達(dá)呈正相關(guān)，r>0.5（P<0.01）；Ang-1、Tie-2 表達(dá)與螺旋動脈數(shù)量呈正相關(guān)，r>0.5（P<0.01）。

表5 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)（Realtime PCR，±s）

表5 各組干預(yù)后Ang-1、Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)（Realtime PCR，±s）

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

組別模型組空白組低劑量組高劑量組阿司匹林組n 6 6 6 6 6 mRNA表達(dá)水平（△ct值）Ang-1 29.24±0.72**32.11±0.78##30.96±1.20*##31.17±0.59##31.03±0.91*##Tie-2 25.71±0.18**28.40±1.21##27.47±1.05#28.85±0.42##28.07±1.97##Ang-2 29.23±1.14*27.16±0.67#28.35±0.78 28.06±1.05 29.19±2.82*

表6 Ang/Tie-2通路與VEGF、螺旋動脈數(shù)量相關(guān)性分析

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腎”在生殖中發(fā)揮著重要的作用，腎精是卵子生長發(fā)育和成熟的物質(zhì)基礎(chǔ)。如《素問·上古天真論》就謂：“腎氣盛……天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子?！蹦I陽虧虛，不能鼓舞腎陰的生化和滋長，同樣也無法使卵子發(fā)育成熟?！芭右匝獮楸尽?，腎氣虧虛，無力推動血液運行，則氣虛血瘀；若腎陽虧虛，血脈失于溫煦，則寒凝血瘀；腎陰不足，虛熱內(nèi)生，煎灼津液，則熱灼血瘀。血瘀既是腎虛病理產(chǎn)物，同時又可導(dǎo)致或加重腎虛，二者互為因果。可見，腎虛為本，血瘀為標(biāo)，腎虛血瘀是不孕癥主要發(fā)病機(jī)制。

導(dǎo)法是將藥物經(jīng)肛門塞入或腸道灌入以治療疾病的一種傳統(tǒng)給藥方法，在不孕癥治療中有其獨特優(yōu)勢。首先，胞宮（子宮和附件）位置與直腸相鄰，導(dǎo)法給藥可使藥物直接作用于胞宮和沖任；其次，藥物溫?zé)岵粻C時使用可起到溫通血脈的作用；同時“肺與大腸相表里”，藥物可經(jīng)“肺朝百脈”的作用輸布于全身[15]。另外，現(xiàn)代研究表明，直腸周圍有豐富的動靜脈和淋巴叢，藥物經(jīng)直腸粘膜吸收，可迅速到達(dá)盆腔，進(jìn)入體循環(huán)，避免肝臟“首過消除效應(yīng)”，藥物吸收和利用度高[16]。據(jù)此，曾倩教授針對腎虛血瘀證是女性不孕癥的主要臨床癥型，自擬補(bǔ)腎活血方經(jīng)導(dǎo)法給藥治療腎虛血瘀型不孕癥，臨床療效較好[8]。補(bǔ)腎活血方由大菟絲子、枸杞子、覆盆子、續(xù)斷、絲瓜絡(luò)、山楂、丹參、山藥八味藥組成。菟絲子陰陽并補(bǔ)，溫而不燥，補(bǔ)而不滯，繞于豆根之間，吸取它物之精華以自養(yǎng)，取類比象，與胚胎居于母體，吸取母體之精華而存活相類似；植物的種子具有繁殖的特性，故取枸杞子補(bǔ)益肝腎，平調(diào)氣血陰陽，滋陰助陽；覆盆子甘平入腎，滋養(yǎng)腎中真陰，益精氣而堅腎氣；續(xù)斷補(bǔ)肝腎、調(diào)沖任，通行百脈，續(xù)血脈而調(diào)氣血；丹參行血破淤而生新；絲瓜絡(luò)通經(jīng)活絡(luò)、山楂行氣散瘀、山藥平補(bǔ)三陰，三者皆可入胃，而沖脈隸屬于陽明，有從陽明治沖任之意，且傅青主認(rèn)為山藥可專補(bǔ)任脈之虛。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血之功效。

本實驗結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方導(dǎo)法給藥，可改善腎虛血瘀-胚胎著床障礙模型大鼠種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)組織學(xué)特征，促進(jìn)螺旋小動脈增生、腺體數(shù)量增多，以及增加大鼠子宮濕重和子宮臟器指數(shù)，促進(jìn)其VEGF、FLK-1 表達(dá)，并提高其子宮組織Ang-1、Tie-2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，并有上調(diào)Ang-2 表達(dá)水平的趨勢。現(xiàn)代生殖醫(yī)學(xué)研究表明，種植窗期是子宮內(nèi)膜允許胚胎著床的關(guān)鍵時期，胚胎植入過程伴隨子宮豐富血管組織的生成[2]，血管組織為胚胎附著和著床提供必需的物質(zhì)，是確保胚胎種植成功的關(guān)鍵[3,15-16]。而Ang/Tie-2 信號通路是血管生成的主要通路之一，在Ang/Tie-2 信號通路中，Ang-1 促進(jìn)血管出芽及分支并維持新生血管完整和穩(wěn)定，Ang-2降低血管穩(wěn)定性，增加血管可塑性，二者競爭性結(jié)合受體Tie-2 發(fā)揮其作用。當(dāng)VEGF 存在時，Ang-2 的表達(dá)使激活的內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF作用下增殖、侵襲、遷移，形成新生血管；當(dāng)VEGF 不存在時，Ang-2 的表達(dá)使血管發(fā)生退行性變，甚至壞死[19]。

因此，補(bǔ)腎活血方經(jīng)導(dǎo)法給藥治療腎虛血瘀型不孕癥的助孕機(jī)制，可能是通過提高子宮組織VEGF、FLK-1、Ang-1、Tie-2 表達(dá)水平，維持Ang-2 正常表達(dá)水平，從而促進(jìn)子宮組織血管新生，并維持新生血管穩(wěn)定，促進(jìn)新生血管成熟，促進(jìn)子宮內(nèi)膜螺旋動脈增生，增加子宮組織血液灌注，以及促進(jìn)子宮內(nèi)膜正常發(fā)育，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床。