杭 筱, 王方方, 凌 玲, 周姝婷, 吳 凡, 楊 蕾, 許 蕾, 郁多男

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

MicroRNA(miRNA)是包含18～25個(gè)核苷酸的一類小分子RNA, 其在多種生物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究[2]表明, miR-144/451基因簇在紅細(xì)胞生成過程中大量表達(dá)，而且能夠調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的終末成熟和抗氧化途徑。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-144/451基因敲除后，小鼠呈現(xiàn)小細(xì)胞溶血性貧血，紅細(xì)胞抗氧化能力下降，紅系前體細(xì)胞的凋亡增加。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Tfr1)是一種跨膜糖蛋白，通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)參與血紅蛋白的合成[4], 在紅細(xì)胞發(fā)育、生成過程中具有重要作用。在胚胎發(fā)育過程中, Tfr1缺乏導(dǎo)致造血干細(xì)胞發(fā)生漸進(jìn)性損傷，造血祖細(xì)胞發(fā)育受阻, Tfr1敲除的小鼠最終胚胎致死[5]。miRNA可靶向Tfr1 的3′非翻譯區(qū)，負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞中Tfr1的表達(dá)[6]。在紅細(xì)胞中, miR-144/451是否參與調(diào)控Tfr1尚未見到報(bào)道。本研究擬通過檢測(cè)野生型小鼠(WT)和miR-144/451基因敲除小鼠(mKO)的Tfr1表達(dá)水平，探討miR-144/451對(duì)紅細(xì)胞Tfr1的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

mKO小鼠是利用傳統(tǒng)的Cre/loxP技術(shù)敲除包括miR-144以及miR-451的前體在內(nèi)的共388個(gè)核苷酸序列[7]。

1.2 骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞的磁珠分選

將WT和mKO小鼠的骨髓、脾臟組織制成細(xì)胞懸液，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液(南京福麥斯公司)，冰上裂解10 min, 加入10 mLPBS終止裂解，離心，棄上清，用100 μL PBS重懸細(xì)胞，每管細(xì)胞懸液中加入20 μL Ter 119磁珠抗體 (德國美天旎公司)，混勻后4 ℃孵育25 min, 加入10 mL PBS終止孵育，離心，棄上清, 500 μL PBS重懸細(xì)胞后在磁珠分選架(德國美天旎公司)進(jìn)行陽選，收集Ter 119陽性的細(xì)胞。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記

將WT和mKO小鼠的胚胎肝、骨髓、脾臟和外周血制成細(xì)胞懸液，加入Ter 119-APC(美國BD公司)和CD71-PE(美國BD公司)2種抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件分析陽性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞中的Tfr1 mRNA表達(dá)水平

Tfr1的熒光定量PCR引物由上海生工生物公司合成。用TRIzol提取骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞中的RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 以此cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)儀器為L(zhǎng)ightCycler96(美國Roche公司)。引物序列[8]及相關(guān)信息見表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)Tfr1、β-actin的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-144/451敲除后胚胎肝和骨髓紅細(xì)胞

中Tfr1的MFI水平

用Ter 119-APC和CD71-PE這2種抗體標(biāo)記小鼠的胚胎肝細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ter 119和CD71強(qiáng)陽性的紅細(xì)胞中Tfr1的MFI, 結(jié)果顯示，相較于WT小鼠, mKO小鼠的胚胎肝細(xì)胞中Tfr1的MFI水平顯著降低(P<0.01)。用同樣的方法檢測(cè)2種小鼠骨髓細(xì)胞，結(jié)果顯示mKO小鼠骨髓中Tfr1的的MFI水平較WT小鼠顯著降低(P<0.01)。見圖1、2。

2.2 miR-144/451敲除后脾臟和外周血紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT和mKO小鼠脾臟和外周血中Ter 119和CD71強(qiáng)陽性的紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比, mKO小鼠脾臟和外周血Ter 119和CD71強(qiáng)陽性細(xì)胞中Tfr1的MFI水平顯著下降(P<0.05)。見圖3、4。

2.3 miR-144/451敲除后骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞的Tfr1 mRNA表達(dá)水平

將磁珠分選得到的骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞分別提取RNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示mKO小鼠骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞的Tfr1 mRNA表達(dá)水平顯著高于WT小鼠組(P<0.05)。見圖5、6。

3 討 論

Tfr1在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，通過胞吞二價(jià)鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物促進(jìn)鐵吸收[9], 是細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子[10]。Tfr1對(duì)紅細(xì)胞生成至關(guān)重要，尤其是紅細(xì)胞發(fā)育早期階段。造血干細(xì)胞中Tfr1的缺失雖不影響胎肝造血干/祖細(xì)胞的產(chǎn)生，但會(huì)顯著損害骨髓中功能性造血干細(xì)胞的增殖。Wang S等[11]實(shí)驗(yàn)組分離Tfr1敲除小鼠的胚胎肝細(xì)胞，并進(jìn)行胚胎肝細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接受Tfr1敲除小鼠胚胎肝細(xì)胞的小鼠在移植后12 d死亡，而對(duì)照組小鼠存活率100%。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfr1敲除小鼠的骨髓和脾臟中紅細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨髓中早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，脾臟中的晚幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組亦顯著下降，說明在紅細(xì)胞的終末成熟過程中, Tfr1的缺失導(dǎo)致紅細(xì)胞發(fā)育過程嚴(yán)重受阻。

A: 流式檢測(cè)胚胎肝紅細(xì)胞中Tfr1的表達(dá)水平; B: 胚胎肝紅細(xì)胞中Tfr1的表達(dá)水平直方圖。與mKO比較, **P<0.01。

圖1 miR-144/451敲除后胚胎肝紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平(n=3)

A: 流式檢測(cè)骨髓紅細(xì)胞中Tfr1的表達(dá)水平; B: 骨髓細(xì)胞中Tfr1的表達(dá)水平直方圖。與mKO比較, **P<0.01。

圖2 miR-144/451敲除后骨髓紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平(n=3)

A: 流式檢測(cè)脾臟紅細(xì)胞中Tfr1的水平; B: 脾臟紅細(xì)胞中Tfr1的水平直方圖。與mKO比較, **P<0.01。

圖3 miR-144/451敲除后脾臟紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平(n=3)

A: 流式檢測(cè)外周血紅細(xì)胞中Tfr1的水平; B: 外周血紅細(xì)胞中Tfr1的水平直方圖。與mKO比較, *P<0.05。

圖4 miR-144/451敲除后外周血紅細(xì)胞中Tfr1的MFI水平(n=3)

與WT比較, ??P<0.01。圖5 miR-144/451敲除后骨髓有核紅細(xì)胞的Tfr1 mRNA表達(dá)水平

與WT比較, ??P<0.01。圖6 miR-144/451敲除后脾臟有核紅細(xì)胞的Tfr1 mRNA表達(dá)水平

本課題組前期研究結(jié)果[7]表明, mKO小鼠呈現(xiàn)小細(xì)胞溶血性貧血，作者推測(cè)此貧血可能與Tfr1降低有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本課題從蛋白和mRNA水平檢測(cè)了Tfr1的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tfr1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與WT小鼠比較, mKO小鼠的胚胎肝細(xì)胞中Ter 119和CD71強(qiáng)陽性細(xì)胞的Tfr1 表達(dá)水平下降，其骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞Ter 119和CD71強(qiáng)陽性細(xì)胞的Tfr1 表達(dá)同樣顯著減少，外周血中Ter 119和CD71強(qiáng)陽性細(xì)胞的Tfr1表達(dá)結(jié)果與胚胎肝、骨髓和脾臟中的Tfr1 表達(dá)一致。mKO小鼠的骨髓和脾臟有核紅細(xì)胞中Tfr1 mRNA的表達(dá)水平卻較WT小鼠組升高，這些研究結(jié)果顯示miR-144/451敲除后Tfr1的蛋白水平降低，但在轉(zhuǎn)錄水平上升高，說明Tfr1可能在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控。miR-144和miR-451的種子序列與人類和小鼠的Rab14 mRNA均表現(xiàn)出Watson-Crick同源性, miR-451已被證明可以直接抑制肺癌中的Rab14 mRNA水平[12]，并且研究[13]報(bào)道在成纖維細(xì)胞中, Rab14能抑制Tfr1的表達(dá)。因此，作者推測(cè)miR-144/451可能通過靶向Rab14調(diào)控紅細(xì)胞Tfr1的表達(dá)。

綜上所述, miR-144/451缺失導(dǎo)致了小鼠紅細(xì)胞中Tfr1減少，這可能是mKO小鼠貧血的原因，但miR-144/451對(duì)Tfr1的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，需要更深入的研究。