丁寶娟 安利佳 蘇 喬

(大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116023)

鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的營(yíng)養(yǎng)元素之一，占植物干重的2%～10%，參與多種生理生化過(guò)程，包括蛋白質(zhì)合成、光合作用和滲透調(diào)節(jié)等[1～2]。地殼中鉀含量豐富，但能被植物吸收利用的速效鉀不足[3]。玉米(ZeamaysL.)作為世界三大糧食作物之一，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。土壤缺鉀嚴(yán)重影響了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過(guò)遺傳改良的方式提高玉米的鉀營(yíng)養(yǎng)是解決這個(gè)問(wèn)題的有效途徑之一。

植物對(duì)鉀的吸收主要依靠鉀離子通道和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體兩大鉀轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，前者主要包括Shaker通道、TPK通道和Kir-like通道[4]，后者主要包括KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運(yùn)體，Trk/Ktr/HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體、KEA轉(zhuǎn)運(yùn)體和CHX轉(zhuǎn)運(yùn)體[5～7]。其中，Shaker通道和KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運(yùn)體是目前研究最為廣泛的兩大家族。目前已從棉花(Gossypiumhirsutum)[8]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[9]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[10]、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[11]和水稻(Oryzasativa)[12]等植物中分離得到AKT1基因。Ahmad等[12]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)OsAKT1基因可以提高水稻的鉀營(yíng)養(yǎng)吸收。Duan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SsAKT1基因在低鉀條件下能夠提高鹽地堿蓬的鉀吸收能力。KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族存在于植物、真菌和細(xì)菌中，參與植物體內(nèi)K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，提高植物的耐鹽性以及對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)[13]。KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體在植物的發(fā)育過(guò)程也起到重要的作用，例如根毛的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素的分布等[14]。目前，研究人員已從碧桃(Prunuspersica)[15]、木薯(Manihotesculenta)[16]、棉花(Gossypiumhirsutum)[17]和柳杉(Cryptomeriajaponica)[18]等植物中克隆得到鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。譚穎等[19]在煙草中過(guò)表達(dá)NtHAK1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的鉀吸收能力。Han等[20]的研究表明，過(guò)表達(dá)KUP7基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的K+吸收。Song等[21]在水稻中過(guò)表達(dá)空心蓮子草的ApKUP3基因，提高了轉(zhuǎn)基因水稻的K+吸收。Wang等[17]在擬南芥中過(guò)表達(dá)GhKT2基因，低鉀條件下轉(zhuǎn)GhKT2基因擬南芥的干重和K+含量顯著高于野生型。

TrkH是一種細(xì)菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在細(xì)菌中的結(jié)構(gòu)和功能已進(jìn)行了詳盡的研究[22]，但在植物中的功能未知。本實(shí)驗(yàn)室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細(xì)菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因trkH(Accession Number:MK863632)，在酵母和煙草中驗(yàn)證了功能。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼胚侵染法，以Hi-Ⅱ基因型的玉米為受體品種，將trkH基因?qū)胗衩字?，通過(guò)鉀耗竭實(shí)驗(yàn)分析了轉(zhuǎn)trkH基因玉米的K+吸收功能，為獲得鉀營(yíng)養(yǎng)高效的玉米新品種奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 植物材料和表達(dá)載體

植物材料為Hi-Ⅱ基因型玉米。植物表達(dá)載體為pTF101:trkH，含有目的基因trkH和篩選標(biāo)記基因Bar，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存(圖1)。

1.2 培養(yǎng)基

玉米轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基及其組成見(jiàn)表1。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化

參照Frame等[23]的方法進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化，方法略有修改，農(nóng)桿菌菌液濃度為OD550=0.35～0.45，抗生素為200 mg·L-1的頭孢噻肟。

圖1 pTF101:trkH載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖Fig.1 Schematic representation of pTF101:trkH vector

表1 培養(yǎng)基組成

1.4 T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行玉米基因組DNA的提取，利用表2中trkH和Bar基因的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 PCR檢測(cè)的引物序列

1.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測(cè)

根據(jù)QuickStixTMKit for LibertyLink?(bar) Cotton Leaf & Seed說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Bar基因的蛋白水平檢測(cè)。

1.6 T1代轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR檢測(cè)

將部分T0代轉(zhuǎn)基因植株與玉米骨干自交系PH6WC雜交，獲得8個(gè)T1代株系。采用TRIZol試劑提取玉米葉片總RNA，根據(jù)大連寶生物公司PrimerScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，以EF-1α為內(nèi)參基因，trkH和EF-1α引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.7 T1代轉(zhuǎn)基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的8個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系玉米種子各30粒，播種到含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，待玉米幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)，噴灑除草劑，統(tǒng)計(jì)T1代轉(zhuǎn)基因株系的分離比。選取分離比接近1∶1的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR檢測(cè)，trkH引物序列見(jiàn)表2，PCR反應(yīng)條件同1.4。統(tǒng)計(jì)PCR檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行χ2測(cè)驗(yàn)。

1.8 T1代轉(zhuǎn)基因植株的鉀離子耗竭分析

切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法[24]提取L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系T1代種子的基因組DNA。為保證遺傳背景盡量一致，經(jīng)PCR檢測(cè)后，以PCR檢測(cè)陽(yáng)性材料為轉(zhuǎn)基因玉米，以PCR檢測(cè)陰性材料為野生型進(jìn)行鉀離子耗竭實(shí)驗(yàn)。將玉米種子進(jìn)行簡(jiǎn)單的表面消毒后于托盤(pán)中萌發(fā)3～5 d。萌發(fā)的玉米幼苗定植到1/2 Hoagland[25]營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行通氣培養(yǎng)，pH6.0，每3天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗長(zhǎng)至四葉一心期時(shí)，分別將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株轉(zhuǎn)移至缺鉀的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，其中，KH2PO4用NaH2PO4替代，KNO3用Ca(NO3)2替代，其余成分相同，饑餓處理48 h。饑餓處理后，將玉米幼苗轉(zhuǎn)移至耗竭液(0.2 mmol CaSO4，1 mmol KCl)中，每隔12 h取樣一次，每次吸取1 mL溶液，并用雙蒸水補(bǔ)足體積，耗竭處理72 h，玉米幼苗在處理期間保持通氣狀態(tài)。采用原子吸收光譜儀測(cè)定樣品中的鉀離子含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼胚侵染法對(duì)玉米Hi-Ⅱ品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，生長(zhǎng)良好的幼胚會(huì)變大且質(zhì)地堅(jiān)硬(圖2:a)；經(jīng)過(guò)7 d的恢復(fù)培養(yǎng)，會(huì)誘導(dǎo)出Ⅱ型愈傷組織，此時(shí)可通過(guò)愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)來(lái)判斷幼胚是否可以轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中(圖2:b)；經(jīng)過(guò)4～6周的篩選培養(yǎng)后，獲得蓬松狀態(tài)的抗性愈傷(圖2:c～d)；將抗性愈傷分成小塊，在再生Ⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，長(zhǎng)出呈乳白色的胚狀體(圖2:e)；挑選生長(zhǎng)健壯的胚狀體轉(zhuǎn)移至再生Ⅱ培養(yǎng)基中，2周后生長(zhǎng)出再生苗(圖2:f)。最終獲得T0代Baster抗性苗21株。

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 a.共培養(yǎng)；b.恢復(fù)；c～d.篩選；e.胚狀體；f.再生植株Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize a.Co-cultivation; b.Resting; c-d.Selection; e.Embryoid; f.Regeneration plant

圖3 轉(zhuǎn)trkH基因植株的PCR檢測(cè) a.trkH基因；b.Bar基因 M.DL2000 Marker；H.ddH2O；WT.野生型植株；1～21.轉(zhuǎn)基因植株Fig.3 PCR detection of the trkH transgenic plants a. trkH gene; b. Bar gene; M. DL2000 Marker; H. ddH2O; WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

圖4 轉(zhuǎn)trkH基因植株的Bar試紙條檢測(cè) WT.野生型植株；1～21.轉(zhuǎn)基因植株Fig.4 Bar strip detection of trkH transgenic plants WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

2.2 T0代Baster抗性植株的鑒定

以提取的玉米基因組DNA為模板，對(duì)目的基因trkH和篩選標(biāo)記基因Bar進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出符合預(yù)期大小的片段，表明目的基因和篩選標(biāo)記基因成功轉(zhuǎn)入到玉米基因組中(圖3)。Bar試紙條檢測(cè)結(jié)果表明，21株抗性苗出現(xiàn)了檢測(cè)線，而野生型植株沒(méi)有出現(xiàn)檢測(cè)線，說(shuō)明Bar基因在蛋白水平上成功表達(dá)(圖4)。

2.3 T1轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR分析

將部分T0代轉(zhuǎn)基因植株與玉米骨干自交系PH6WC進(jìn)行雜交，收獲8個(gè)T1代株系。半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，T1代株系在轉(zhuǎn)錄水平上均能表達(dá)，且表達(dá)量差異不大(圖5)。

圖5 T1代轉(zhuǎn)trkH基因植株的半定量RT-PCR WT.野生型植株；L1～L8.轉(zhuǎn)基因植株Fig.5 Semi-quantitative RT-PCR detection of T1trkH transgenic plants WT. Wild type; L1-L8. Transgenic plants

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的T1代轉(zhuǎn)基因株系玉米種子各30粒，三葉一心期時(shí)噴灑除草劑，非抗性植株葉片逐漸萎黃，直至死亡。然后統(tǒng)計(jì)分離比，選擇其中比例接近1∶1的L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR檢測(cè)。切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法提取玉米基因組DNA，將其作為模板，利用trkH基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)PCR檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行χ2測(cè)驗(yàn)，結(jié)果表明L3、L5和L7轉(zhuǎn)化株系的后代均符合孟德?tīng)柗蛛x定律(表3)。

表3 轉(zhuǎn)trkH基因玉米T1代遺傳分析

注：PCR+.陽(yáng)性植株；PCR-.陰性植株χ2=3.841，P<0.05

Note:PCR+.Positive plants; PCR-.Negative plantsχ2=3.841，P<0.05

圖6 T1代轉(zhuǎn)trkH基因植株在1 mmol K+濃度下的耗竭實(shí)驗(yàn)Fig.6 Depletion experiment of T1trkH transgenic plants at 1 mmol K+ concentration

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株的K+耗竭實(shí)驗(yàn)

為評(píng)估低K+脅迫下過(guò)表達(dá)trkH基因能否提高轉(zhuǎn)基因玉米的K+吸收能力，挑選四葉一心期的轉(zhuǎn)基因和野生型玉米進(jìn)行K+耗竭實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在1 mmol K+濃度條件下耗竭處理72 h，L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因玉米的K+吸收能力高于野生型(圖6)。

3 討論

土壤缺鉀影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，培育鉀營(yíng)養(yǎng)高效的玉米品種是解決這個(gè)問(wèn)題的途徑之一。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼胚侵染法將細(xì)菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因trkH轉(zhuǎn)入玉米Hi-Ⅱ幼胚中。PCR檢測(cè)結(jié)果初步表明外源基因trkH成功轉(zhuǎn)入玉米基因組中。半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明trkH基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。Bar試紙條檢測(cè)結(jié)果表明Bar基因在蛋白水平上表達(dá)。將T0代轉(zhuǎn)基因株系與PH6WC雜交，對(duì)其后代進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果符合1∶1的孟德?tīng)柗蛛x比，推測(cè)L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系為單拷貝且可以穩(wěn)定遺傳。玉米苗期鉀耗竭實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米的鉀吸收能力高于野生型，與Ahmad等[12]在水稻中過(guò)表達(dá)OsAKT1基因、Han等[20]在擬南芥中過(guò)表達(dá)KUP7基因和Song等[21]在水稻中過(guò)表達(dá)ApKUP3基因的研究結(jié)果一致。

細(xì)菌Trk系統(tǒng)主要包括介導(dǎo)K+轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜亞基TrkH或TrkG以及外圍調(diào)節(jié)亞基TrkA，多數(shù)情況下細(xì)菌中TrkH實(shí)現(xiàn)K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)需要TrkA的輔助調(diào)節(jié)；真菌中的Trk系統(tǒng)表現(xiàn)為單一亞基結(jié)構(gòu)，只有介導(dǎo)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜亞基，并沒(méi)有輔助的調(diào)節(jié)亞基。推測(cè)可能是由于真核系統(tǒng)較為復(fù)雜，有其他提供能量或者調(diào)節(jié)激活的機(jī)制[5,22,26～27]。本實(shí)驗(yàn)室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細(xì)菌鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因trkH，在酵母和煙草中驗(yàn)證了其功能，結(jié)果表明TrkH在高等生物中可以不依賴于TrkA發(fā)揮鉀吸收的功能。本研究表明單獨(dú)過(guò)表達(dá)trkH基因能夠提高轉(zhuǎn)基因玉米的鉀吸收能力，為培育鉀營(yíng)養(yǎng)高效玉米新品種奠定基礎(chǔ)。