丁寶娟 安利佳 蘇 喬

(大連理工大學生物工程學院，大連 116023)

鉀是植物生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)元素之一，占植物干重的2%～10%，參與多種生理生化過程，包括蛋白質(zhì)合成、光合作用和滲透調(diào)節(jié)等[1～2]。地殼中鉀含量豐富，但能被植物吸收利用的速效鉀不足[3]。玉米(ZeamaysL.)作為世界三大糧食作物之一，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。土壤缺鉀嚴重影響了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過遺傳改良的方式提高玉米的鉀營養(yǎng)是解決這個問題的有效途徑之一。

植物對鉀的吸收主要依靠鉀離子通道和鉀離子轉(zhuǎn)運體兩大鉀轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，前者主要包括Shaker通道、TPK通道和Kir-like通道[4]，后者主要包括KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運體，Trk/Ktr/HKT轉(zhuǎn)運體、KEA轉(zhuǎn)運體和CHX轉(zhuǎn)運體[5～7]。其中，Shaker通道和KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運體是目前研究最為廣泛的兩大家族。目前已從棉花(Gossypiumhirsutum)[8]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[9]、鹽地堿蓬(Suaedasalsa)[10]、霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[11]和水稻(Oryzasativa)[12]等植物中分離得到AKT1基因。Ahmad等[12]研究發(fā)現(xiàn)過表達OsAKT1基因可以提高水稻的鉀營養(yǎng)吸收。Duan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，過表達SsAKT1基因在低鉀條件下能夠提高鹽地堿蓬的鉀吸收能力。KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運體家族存在于植物、真菌和細菌中，參與植物體內(nèi)K+的吸收和轉(zhuǎn)運，提高植物的耐鹽性以及對干旱脅迫的反應[13]。KUP/HAK/KT鉀轉(zhuǎn)運體在植物的發(fā)育過程也起到重要的作用，例如根毛的生長和生長素的分布等[14]。目前，研究人員已從碧桃(Prunuspersica)[15]、木薯(Manihotesculenta)[16]、棉花(Gossypiumhirsutum)[17]和柳杉(Cryptomeriajaponica)[18]等植物中克隆得到鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因。譚穎等[19]在煙草中過表達NtHAK1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的鉀吸收能力。Han等[20]的研究表明，過表達KUP7基因能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的K+吸收。Song等[21]在水稻中過表達空心蓮子草的ApKUP3基因，提高了轉(zhuǎn)基因水稻的K+吸收。Wang等[17]在擬南芥中過表達GhKT2基因，低鉀條件下轉(zhuǎn)GhKT2基因擬南芥的干重和K+含量顯著高于野生型。

TrkH是一種細菌鉀轉(zhuǎn)運蛋白，其在細菌中的結(jié)構(gòu)和功能已進行了詳盡的研究[22]，但在植物中的功能未知。本實驗室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細菌鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因trkH(Accession Number:MK863632)，在酵母和煙草中驗證了功能。本研究采用農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法，以Hi-Ⅱ基因型的玉米為受體品種，將trkH基因?qū)胗衩字校ㄟ^鉀耗竭實驗分析了轉(zhuǎn)trkH基因玉米的K+吸收功能，為獲得鉀營養(yǎng)高效的玉米新品種奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 植物材料和表達載體

植物材料為Hi-Ⅱ基因型玉米。植物表達載體為pTF101:trkH，含有目的基因trkH和篩選標記基因Bar，為本實驗室構(gòu)建和保存(圖1)。

1.2 培養(yǎng)基

玉米轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基及其組成見表1。

1.3 農(nóng)桿菌介導的玉米遺傳轉(zhuǎn)化

參照Frame等[23]的方法進行玉米轉(zhuǎn)化，方法略有修改，農(nóng)桿菌菌液濃度為OD550=0.35～0.45，抗生素為200 mg·L-1的頭孢噻肟。

圖1 pTF101:trkH載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig.1 Schematic representation of pTF101:trkH vector

表1 培養(yǎng)基組成

1.4 T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒進行玉米基因組DNA的提取，利用表2中trkH和Bar基因的引物分別進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

表2 PCR檢測的引物序列

1.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株Bar試紙條檢測

根據(jù)QuickStixTMKit for LibertyLink?(bar) Cotton Leaf & Seed說明書進行Bar基因的蛋白水平檢測。

1.6 T1代轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR檢測

將部分T0代轉(zhuǎn)基因植株與玉米骨干自交系PH6WC雜交，獲得8個T1代株系。采用TRIZol試劑提取玉米葉片總RNA，根據(jù)大連寶生物公司PrimerScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行半定量RT-PCR檢測，以EF-1α為內(nèi)參基因，trkH和EF-1α引物序列見表2。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，27個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.7 T1代轉(zhuǎn)基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的8個T1代轉(zhuǎn)基因株系玉米種子各30粒，播種到含有營養(yǎng)土的花盆中，待玉米幼苗長至三葉一心期時，噴灑除草劑，統(tǒng)計T1代轉(zhuǎn)基因株系的分離比。選取分離比接近1∶1的轉(zhuǎn)基因株系進行PCR檢測，trkH引物序列見表2，PCR反應條件同1.4。統(tǒng)計PCR檢測結(jié)果并進行χ2測驗。

1.8 T1代轉(zhuǎn)基因植株的鉀離子耗竭分析

切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法[24]提取L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系T1代種子的基因組DNA。為保證遺傳背景盡量一致，經(jīng)PCR檢測后，以PCR檢測陽性材料為轉(zhuǎn)基因玉米，以PCR檢測陰性材料為野生型進行鉀離子耗竭實驗。將玉米種子進行簡單的表面消毒后于托盤中萌發(fā)3～5 d。萌發(fā)的玉米幼苗定植到1/2 Hoagland[25]營養(yǎng)液中進行通氣培養(yǎng)，pH6.0，每3天更換一次營養(yǎng)液。待幼苗長至四葉一心期時，分別將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株轉(zhuǎn)移至缺鉀的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中，其中，KH2PO4用NaH2PO4替代，KNO3用Ca(NO3)2替代，其余成分相同，饑餓處理48 h。饑餓處理后，將玉米幼苗轉(zhuǎn)移至耗竭液(0.2 mmol CaSO4，1 mmol KCl)中，每隔12 h取樣一次，每次吸取1 mL溶液，并用雙蒸水補足體積，耗竭處理72 h，玉米幼苗在處理期間保持通氣狀態(tài)。采用原子吸收光譜儀測定樣品中的鉀離子含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法對玉米Hi-Ⅱ品種進行遺傳轉(zhuǎn)化。在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，生長良好的幼胚會變大且質(zhì)地堅硬(圖2:a)；經(jīng)過7 d的恢復培養(yǎng)，會誘導出Ⅱ型愈傷組織，此時可通過愈傷組織的生長狀態(tài)來判斷幼胚是否可以轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中(圖2:b)；經(jīng)過4～6周的篩選培養(yǎng)后，獲得蓬松狀態(tài)的抗性愈傷(圖2:c～d)；將抗性愈傷分成小塊，在再生Ⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，長出呈乳白色的胚狀體(圖2:e)；挑選生長健壯的胚狀體轉(zhuǎn)移至再生Ⅱ培養(yǎng)基中，2周后生長出再生苗(圖2:f)。最終獲得T0代Baster抗性苗21株。

圖2 農(nóng)桿菌介導玉米的遺傳轉(zhuǎn)化 a.共培養(yǎng)；b.恢復；c～d.篩選；e.胚狀體；f.再生植株Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize a.Co-cultivation; b.Resting; c-d.Selection; e.Embryoid; f.Regeneration plant

圖3 轉(zhuǎn)trkH基因植株的PCR檢測 a.trkH基因；b.Bar基因 M.DL2000 Marker；H.ddH2O；WT.野生型植株；1～21.轉(zhuǎn)基因植株Fig.3 PCR detection of the trkH transgenic plants a. trkH gene; b. Bar gene; M. DL2000 Marker; H. ddH2O; WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

圖4 轉(zhuǎn)trkH基因植株的Bar試紙條檢測 WT.野生型植株；1～21.轉(zhuǎn)基因植株Fig.4 Bar strip detection of trkH transgenic plants WT. Wild type; 1-21. Transgenic plants

2.2 T0代Baster抗性植株的鑒定

以提取的玉米基因組DNA為模板，對目的基因trkH和篩選標記基因Bar進行PCR檢測，擴增出符合預期大小的片段，表明目的基因和篩選標記基因成功轉(zhuǎn)入到玉米基因組中(圖3)。Bar試紙條檢測結(jié)果表明，21株抗性苗出現(xiàn)了檢測線，而野生型植株沒有出現(xiàn)檢測線，說明Bar基因在蛋白水平上成功表達(圖4)。

2.3 T1轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR分析

將部分T0代轉(zhuǎn)基因植株與玉米骨干自交系PH6WC進行雜交，收獲8個T1代株系。半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，T1代株系在轉(zhuǎn)錄水平上均能表達，且表達量差異不大(圖5)。

圖5 T1代轉(zhuǎn)trkH基因植株的半定量RT-PCR WT.野生型植株；L1～L8.轉(zhuǎn)基因植株Fig.5 Semi-quantitative RT-PCR detection of T1trkH transgenic plants WT. Wild type; L1-L8. Transgenic plants

2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的遺傳分析

選取籽粒飽滿的T1代轉(zhuǎn)基因株系玉米種子各30粒，三葉一心期時噴灑除草劑，非抗性植株葉片逐漸萎黃，直至死亡。然后統(tǒng)計分離比，選擇其中比例接近1∶1的L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系進行PCR檢測。切取少量玉米胚乳組織，采用堿煮法提取玉米基因組DNA，將其作為模板，利用trkH基因的引物進行PCR擴增，統(tǒng)計PCR檢測結(jié)果并進行χ2測驗，結(jié)果表明L3、L5和L7轉(zhuǎn)化株系的后代均符合孟德爾分離定律(表3)。

表3 轉(zhuǎn)trkH基因玉米T1代遺傳分析

注：PCR+.陽性植株；PCR-.陰性植株χ2=3.841，P<0.05

Note:PCR+.Positive plants; PCR-.Negative plantsχ2=3.841，P<0.05

圖6 T1代轉(zhuǎn)trkH基因植株在1 mmol K+濃度下的耗竭實驗Fig.6 Depletion experiment of T1trkH transgenic plants at 1 mmol K+ concentration

2.5 T1代轉(zhuǎn)基因植株的K+耗竭實驗

為評估低K+脅迫下過表達trkH基因能否提高轉(zhuǎn)基因玉米的K+吸收能力，挑選四葉一心期的轉(zhuǎn)基因和野生型玉米進行K+耗竭實驗。結(jié)果表明，在1 mmol K+濃度條件下耗竭處理72 h，L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因玉米的K+吸收能力高于野生型(圖6)。

3 討論

土壤缺鉀影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，培育鉀營養(yǎng)高效的玉米品種是解決這個問題的途徑之一。本研究通過農(nóng)桿菌介導的幼胚侵染法將細菌鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因trkH轉(zhuǎn)入玉米Hi-Ⅱ幼胚中。PCR檢測結(jié)果初步表明外源基因trkH成功轉(zhuǎn)入玉米基因組中。半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明trkH基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達。Bar試紙條檢測結(jié)果表明Bar基因在蛋白水平上表達。將T0代轉(zhuǎn)基因株系與PH6WC雜交，對其后代進行PCR檢測，結(jié)果符合1∶1的孟德爾分離比，推測L3、L5和L7轉(zhuǎn)基因株系為單拷貝且可以穩(wěn)定遺傳。玉米苗期鉀耗竭實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米的鉀吸收能力高于野生型，與Ahmad等[12]在水稻中過表達OsAKT1基因、Han等[20]在擬南芥中過表達KUP7基因和Song等[21]在水稻中過表達ApKUP3基因的研究結(jié)果一致。

細菌Trk系統(tǒng)主要包括介導K+轉(zhuǎn)運的跨膜亞基TrkH或TrkG以及外圍調(diào)節(jié)亞基TrkA，多數(shù)情況下細菌中TrkH實現(xiàn)K+跨膜轉(zhuǎn)運需要TrkA的輔助調(diào)節(jié)；真菌中的Trk系統(tǒng)表現(xiàn)為單一亞基結(jié)構(gòu)，只有介導離子轉(zhuǎn)運的跨膜亞基，并沒有輔助的調(diào)節(jié)亞基。推測可能是由于真核系統(tǒng)較為復雜，有其他提供能量或者調(diào)節(jié)激活的機制[5,22,26～27]。本實驗室前期從海洋微生物宏基因組DNA中克隆得到細菌鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因trkH，在酵母和煙草中驗證了其功能，結(jié)果表明TrkH在高等生物中可以不依賴于TrkA發(fā)揮鉀吸收的功能。本研究表明單獨過表達trkH基因能夠提高轉(zhuǎn)基因玉米的鉀吸收能力，為培育鉀營養(yǎng)高效玉米新品種奠定基礎(chǔ)。