肖 嵐 李 誠 杜 昕 劉妍佳

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625014;2 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院,四川 成都 610100)

牦牛(Bos mutus或Bos grunniens)是生長在海拔3 000 米以上的特殊家畜。經(jīng)過世代的自然選擇,牦牛對低氧環(huán)境有著極好的適應(yīng)性,這可能與牦牛血液富含血紅蛋白有關(guān)[1-3],這為利用牦牛血紅蛋白制備生物活性肽奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本試驗在前期研究中采用菌酶聯(lián)合發(fā)酵制備出牦牛血低聚肽[4];郝剛等[5]采用胰蛋白酶水解牦牛血,Sephadex G-15 凝膠柱分離,再經(jīng)反相高效液相色譜(eversed high performance liquid chromatography,RP-HPLC) 反復(fù)純化,制得2個色譜純的抗菌肽YakB-1和YakB-2;孫騫等[6]采用AS1.398 中性蛋白酶水解制備牦牛血紅蛋白活性肽;韓學(xué)燕等[7]利用中性蛋白酶水解牦牛血紅蛋白制備蛋白多肽粉;姚星辰等[8]報道牛血活性蛋白具有顯著延長小鼠抗缺氧時間的作用。然而,關(guān)于牦牛血低聚肽是否具有抗缺氧作用卻鮮見報道。研究表明,機體抗缺氧能力提高,運動能力也隨之提高[9]。目前,關(guān)于大豆肽[10]、花生肽[11-12]和豬血多肽[13]緩解疲勞的作用已有報道,而有關(guān)牦牛血低聚肽是否具有抗疲勞作用卻鮮見報道。

H9c2 心肌細胞株是一種從大鼠胚胎心臟分離出來的心肌細胞[14],具有心肌細胞的特征且性質(zhì)穩(wěn)定[15]。動物缺氧可導(dǎo)致心肌供氧減少,進而發(fā)生一系列病理變化[16],故常用此細胞來研究缺氧誘導(dǎo)心肌細胞損傷、缺氧/復(fù)氧心肌損傷、氧化應(yīng)激心肌損傷、心肌退行性疾病等[17-18]。此外,本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)[19]牦牛血低聚肽的體外抗氧化活性優(yōu)于商品化大豆低聚肽,將這2種低聚肽按比例組合后,復(fù)合低聚肽在DPPH 模型和脂質(zhì)過氧化抑制能力模型中表現(xiàn)出拮抗作用;在ABTS 模型中表現(xiàn)協(xié)同作用。因此,本試驗通過體外培養(yǎng)H9c2 心肌細胞建立缺氧損傷模型探討牦牛血低聚肽的抗缺氧作用,并通過小鼠游泳抗疲勞試驗進一步驗證復(fù)合低聚肽的互作關(guān)系,并探究其抗疲勞作用。本研究以期為有效提高牦牛血附加值提供理論依據(jù),同時對保護藏區(qū)環(huán)境、牧民脫貧增收也有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9c2 心肌細胞株,生工生物工程(上海)股份有限公司;SPF 級KM 小鼠,雄性,動物合格證號:SCXK(川)2015-030,體質(zhì)量18～22 g,成都達碩實驗動物中心。

牦牛血低聚肽(氨基酸含量85.25 g·100g-1,平均分子量＜1 kDa),自制[4];大豆低聚肽[肽含量(以干基計)≥80%,相對分子質(zhì)量＜2 kDa,蛋白質(zhì)水解物所占比例≥80 g·100g-1)],中食都慶(山東)生物技術(shù)有限公司;DMEM 高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium)(GIBCO,貨號:1670291)、大鼠心肌細胞完全培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO,貨號:10099-141),賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;0.25% Trypsin(GIBCO,貨號:15050065),賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;紅景天苷標準品(貨號:SS8080),索來形容詞生物科技有限公司;CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Beyotime,貨號:C0037),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;肝糖原試劑盒、血乳酸試劑盒、血清尿素氮試劑盒、總蛋白測試盒,南京建成生物工程研究所。

表1 牦牛血低聚肽的氨基酸組成Table1 Amino acid composition of yak blood oligopeptides

表2 牦牛血低聚肽的分子量分布Table2 Molecular weight distribution of yak blood oligopeptides

1.2 儀器與設(shè)備

HF-100型三氣培養(yǎng)箱,上海力申科學(xué)儀器有限公司;5702R 低速離心機,Eppendorf 艾本德中國有限公司;IX51 倒置顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司;MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱,SANYO 三洋中國有限公司;SW-CJ-1FD 超凈工作臺,蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司;UV-1800 紫外分光光度計,日本島津公司;Multiskan MK3 全自動酶標儀,賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛血低聚肽抗缺氧活性的測定

1.3.1.1 細胞株與分組 H9c2細胞置于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM 高糖培養(yǎng)基中復(fù)蘇并培養(yǎng)融合至80%～90%后,將H9c2細胞隨機分組。

1.3.1.2 不同濃度牦牛血低聚肽細胞毒性的評估 H9c2細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)后,待細胞密度達到80%時對細胞進行傳代。用0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集細胞;用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS,0.01 mol·L-1,pH值7.2～7.3)將細胞潤洗2次,1 200 r·min-1離心3 min;加入大鼠心肌細胞完全培養(yǎng)基,吹打細胞,制成單細胞懸液,按1 ∶3的比例傳代,37℃、5%CO2飽和濕度條件下擴大培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的H9c2細胞,用培養(yǎng)基(10%FBS+1%雙抗)調(diào)整細胞密度至5×104mL-1,接入96 孔板,每組3個復(fù)孔,每孔100 μL細胞懸液,并設(shè)置空白孔,在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL 無菌PBS,于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜;低聚肽按照0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、1.600、3.200 mg·mL-1加入96 孔板,同時設(shè)置正常對照組,每組5個復(fù)孔,于37℃、5% CO2飽和濃度條件下培養(yǎng)4 h[19]。

1.3.1.3 H9c2細胞缺氧模型建立細胞正常培養(yǎng)24 h后更換為缺氧培養(yǎng)基(含2% FBS),對照組繼續(xù)常氧培養(yǎng),缺氧組置于含2%氧氣的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別培養(yǎng)24、36、48、72、96 h,確定最佳培養(yǎng)時間。試驗分組:正常對照組、缺氧組、低聚肽低劑量組(0.05 mg·mL-1)、低聚肽中劑量組(0.40 mg·mL-1)、低聚肽高劑量組(3.20 mg·mL-1)、陽性對照組(200 μg·mL-1紅景天苷組)。其中,正常對照組常氧條件培養(yǎng),加藥組加藥預(yù)處理4 h后換為缺氧培養(yǎng)基(含2%FBS)并置于三氣培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)48 h。

1.3.1.4 細胞存活測定細胞處理結(jié)束后,按CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒操作說明書進行試驗,用酶標儀測定各孔吸光值OD450,重復(fù)測定3次。

1.3.2 牦牛血低聚肽抗疲勞活性的研究

1.3.2.1 動物喂養(yǎng) 將小鼠隨機分為5 組,灌胃4周,1次/d,對照組(等體積生理鹽水,10 mL·kg-1)、牦牛血低聚肽組(1 500 mg·kg-1),混合低聚肽A 組(1 500 mg·kg-1,牦牛血低聚肽與大豆低聚肽質(zhì)量比9 ∶1)、混合低聚肽B 組(1 500 mg·kg-1,牦牛血低聚肽與大豆低聚肽質(zhì)量比1 ∶9)、混合低聚肽C 組(1 500 mg·kg-1,牦牛血低聚肽與大豆低聚肽質(zhì)量比5 ∶5)。自由攝食和飲水,并在灌胃后觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動、覓食量等情況。

1.3.2.2 小鼠負重游泳試驗 參考查圣華[20]的方法,末次給抗疲勞組小鼠受試物30 min后,置于游泳箱中游泳,水深約35 cm,水溫保持在25±1℃,小鼠尾根部負荷5%體重的鉛絲。記錄小鼠自由泳開始至死亡的時間,作為小鼠負重游泳時間。

1.3.2.3 生化指標測定 末次灌胃30 min后,每組隨機取出10 只小鼠,在25±1℃的水中無負重游泳30 min,取出后休息60 min,拔眼球采全血,當(dāng)試驗小鼠停止呼吸,處理小鼠取其肝臟組織,于-80℃保存,按照試劑盒操作書說明測定肝糖原(hepatic glycogen,HG)、血乳酸(blood lactic acid,BLA)含量以及血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析處理數(shù)據(jù),P＜0.05表示存在顯著差異,P＜0.01表示存在極顯著差異。使用Microsoft Office Excel 2017、SPSS 19.0和Origin Pro 2017 等軟件分析數(shù)據(jù)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛血低聚肽對H9c2細胞缺氧的保護作用

2.1.1 不同濃度牦牛血低聚肽對H9c2細胞毒性的評估 由圖1可知,不同濃度牦牛血低聚肽對H9c2細胞存活均未產(chǎn)生顯著差異(P＞0.05),說明牦牛血低聚肽在試驗濃度內(nèi)無顯著細胞毒性。

2.1.2 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞存活率的影響

2.1.2.1 不同缺氧時間對H9c2細胞存活率的影響 由圖2可知,當(dāng)細胞缺氧時間超過24 h時,與常氧對照組相比,其對應(yīng)缺氧組細胞存活率均極顯著降低(P＜0.01)。細胞缺氧48 h時,常氧對照組的細胞存活率為254.3%,而缺氧組的細胞存活率僅為85.0%。因此,細胞缺氧模型的暴露時間以48 h為宜。

圖1 不同濃度牦牛血低聚肽對H9c2細胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of yak blood oligopeptides on H9c2 cell viability

圖2 不同缺氧時間對H9c2細胞存活率的影響Fig.2 Effect of different hypoxia time on survival rate of H9c2 cells

2.1.2.2 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞存活率的影響 由圖3可知,與正常對照組相比,缺氧H9c2細胞存活率均呈現(xiàn)一定程度的下降。與缺氧組相比,中、高劑量牦牛血低聚肽組以及紅景天苷組均極顯著提高H9c2 缺氧細胞的存活率(P＜0.01)。然而,中、高和低劑量組干預(yù)的缺氧細胞存活率均極顯著低于紅景天苷組(P＜0.01)。表明,牦牛血低聚肽具有改善缺氧H9c2細胞存活率的作用,且存在劑量依賴性。與常用的抗缺氧藥物紅景天苷比較,高劑量組細胞存活率為75.1%,而紅景天苷組為88.0%,表明牦牛血低聚肽改善缺氧細胞存活率的作用弱于紅景天苷。

2.2 牦牛血低聚肽對小鼠的抗疲勞作用

2.2.1 牦牛血低聚肽對小鼠體重的影響 由表4可知,各組小鼠經(jīng)灌胃4 周后,其體重均有不同程度的增加,但各給藥組小鼠的體重漲幅均低于對照組,但差異不顯著(P＞0.05)。且在喂養(yǎng)4 周未發(fā)現(xiàn)小鼠異常或死亡,表明灌胃低聚肽對小鼠無毒副作用。

表4 牦牛血低聚肽對小鼠體重的影響(n=10)Table4 Effect of yak blood oligopeptides on body weight in mice(n=10)/g

2.2.2 牦牛血低聚肽對小鼠負重游泳時間的影響 由表5可知,與對照組相比,低聚肽干預(yù)小鼠均能延長小鼠的負重游泳時間。牦牛血低聚肽組、混合低聚肽C 組小鼠負重游泳時間極顯著高于對照組(P＜0.01),混合低聚肽A 組顯著高于對照組(P＜0.05),表明低聚肽可能具有抗疲勞的作用。與牦牛血低聚肽組相比,混合低聚肽C 組小鼠的負重游泳時間最長,增加近41%;混合低聚肽A 組、B 組小鼠的負重游泳時間均不及牦牛血低聚肽組。表明牦牛血低聚肽與大豆低聚肽按照5 ∶5 混合組成復(fù)合肽的抗疲勞能力最好。

圖3 牦牛血低聚肽對缺氧H9c2細胞存活率的影響Fig.3 Effect of yak blood oligopeptide on survival rate of hypoxia H9c2 cells

表5 牦牛血低聚肽對小鼠負重游泳時間的影響(n=10)Table5 Effect of yak blood oligopeptides on swimming time in mice(n=10)/min

2.2.3 牦牛血低聚肽對BUN含量的影響 BUN是反映機體疲勞程度的重要指標[21]。長時間運動后,機體不能通過糖代謝和脂肪代謝產(chǎn)生足夠能量,蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮化合物降解脫氨基形成尿素[22],導(dǎo)致參與肝臟鳥氨酸循環(huán)的氨增多,使得BUN含量升高[23]。由表6可知,與對照組相比,混合低聚肽C 組小鼠肝臟內(nèi)BUN含量最低,之后依次是牦牛血低聚肽組、混合低聚肽A 組和B 組。表明低聚肽干預(yù)可降低小鼠BUN含量。

2.2.4 牦牛血低聚肽對BLA含量的影響 機體高強度運動使細胞處于相對缺氧狀態(tài),糖酵解加快[24],大量乳酸在肌肉堆積,加重機體疲勞,肌乳酸會滲入血液,使BLA含量上升,直至二者平衡。因此,運動后BLA含量的變化是衡量抗疲勞效果的重要指標[25]。由表7可知,低聚肽各組小鼠運動后BLA含量均顯著或極顯著低于對照組,混合低聚肽C 組的BLA含量最低,之后依次是混合低聚肽A 組、牦牛血低聚肽組和混合低聚肽B 組。表明牦牛血低聚肽及其混合低聚肽均能有效降低運動疲勞物質(zhì)BLA的產(chǎn)生,其與提高乳酸脫氫酶活性,加速BLA 循環(huán)及其清除速率有關(guān),從而增強機體抗疲勞的能力。

2.2.5 牦牛血低聚肽對HG含量的影響 HG 作為機體供能的重要能量來源之一,運動越劇烈消耗越大。為維持穩(wěn)定的血糖濃度,HG 會不斷轉(zhuǎn)化成血糖[26],進而抑制HG 合成[27],因此HG含量可衡量機體抗疲勞能力[28]。由表8可知,低聚肽各組均能提高小鼠HG含量,表明低聚肽可以增加小鼠機體HG的儲備。與對照組相比,牦牛血低聚肽極顯著增加小鼠的HG含量(P＜0.01),上調(diào)小鼠HG的效果最好;其次是混合低聚肽C 組,顯著增加小鼠HG含量(P＜0.05);混合低聚肽B 組效果最差,僅能提高小鼠HG含量15.4%。結(jié)果表明,牦牛血低聚肽對維持疲勞小鼠HG 穩(wěn)定效果最好。

表6 牦牛血低聚肽對小鼠BUN含量的影響(n=10)Table6 Effect of yak blood oligopeptides on serum urea nitrogen content in mice(n=10)/(mmol·L-1)

表7 牦牛血低聚肽對小鼠BLA含量的影響(n=10)Table7 Effect of yak blood oligopeptides on blood lactic acid in mice(n=10)/(mmol·L-1)

表8 牦牛血低聚肽對小鼠HG含量的影響(n=10)Table8 Effect of yak blood oligopeptides on liver glycogen content in mice(n=10)/(mg·g-1)

3 討論

本研究選用H9c2 大鼠心肌細胞建立缺氧損傷心肌細胞模型,研究牦牛血低聚肽對缺氧H9c2 大鼠心肌細胞的保護作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與常氧對照組相比,缺氧48 h H9c2 大鼠心肌細胞存活率極顯著降低(P＜0.01),表明缺氧介導(dǎo)了心肌細胞的損傷。而高、中、低劑量的牦牛血低聚肽均能提高缺氧損傷的H9c2細胞的存活率,表明牦牛血低聚肽對心肌細胞H9c2 具有保護作用,關(guān)于其作用機制將進一步研究。

運動性疲勞是一個綜合的癥狀[29],機體高強度運動后產(chǎn)生過多自由基[30-31],大量研究證實[32-34],外源性抗氧化物質(zhì)能與內(nèi)源性自由基相互作用,增強機體抗氧化防御能力、減輕疲勞。本研究前期對高、中、低劑量(365、700、1 500 mg·kg-1)牦牛血低聚肽的體內(nèi)抗氧化能力進行研究,確定牦牛血低聚肽對小鼠的抗氧化能力呈現(xiàn)劑量耐性,高劑量組的抗氧化能力最佳。因此,本研究選擇高劑量牦牛血低聚肽研究其對小鼠抗疲勞能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低聚肽抑制小鼠體重的

增長,但無統(tǒng)計學(xué)意義;這與尹軍杰[10]和胡濱等[13]的研究結(jié)果不一致,可能與牦牛血低聚肽、大豆低聚肽呈現(xiàn)一定的苦味有關(guān),從而導(dǎo)致給藥組小鼠的攝食量減少,體重增長緩慢;另外,也可能與本研究選用的是高劑量有關(guān)。因此,后續(xù)開發(fā)牦牛血低聚肽功能食品,需考慮包埋、微膠囊等技術(shù)解決低聚肽苦味的問題。本研究結(jié)果表明,牦牛血低聚肽能夠極顯著提高小鼠負重游泳時間,提高運動后小鼠體內(nèi)HG含量,降低運動后小鼠BLA含量和BUN含量,判定牦牛血低聚肽具有一定的抗疲勞能力[20]。

牦牛血低聚肽與大豆低聚肽組合后的復(fù)合肽具有良好的抗疲勞作用。本研究發(fā)現(xiàn),混合低聚肽C 組的抗疲勞效果最優(yōu),對提高小鼠負重游泳時間、降低運動后小鼠BLA含量和BUN含量的效果均優(yōu)于單獨使用牦牛血低聚肽,但牦牛血低聚肽對提高運動后小鼠體內(nèi)HG含量的效果優(yōu)于混合低聚肽C 組。關(guān)于食源性低聚肽的抗氧化、抗缺氧、抗疲勞的互作作用鮮有相關(guān)報道。本研究還發(fā)現(xiàn),不同比例組合的復(fù)合低聚肽對不同的抗疲勞指標的影響不一樣;復(fù)合低聚肽需有適當(dāng)?shù)谋壤拍鼙憩F(xiàn)出較單一低聚肽更好的抗疲勞能力,且同一比例組合的復(fù)合低聚肽在不同的代謝途徑中發(fā)揮的互作作用存在差異。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)牦牛血低聚肽具有抗疲勞的能力,且牦牛血低聚肽與大豆低聚肽按5 ∶5進行組合后小鼠的抗疲勞能力優(yōu)于單獨使用牦牛血低聚肽組,表明功能性低聚肽按照適當(dāng)比例組合后具有協(xié)同作用。牦牛血低聚肽能夠在一定劑量條件下提高缺氧(37℃,2%O2)條件下大鼠H9c2 心肌細胞的存活率,表現(xiàn)出良好的缺氧細胞損傷防護功效,表明牦牛血低聚肽具有抗缺氧的能力,關(guān)于其抗缺氧能力的作用機制將在后續(xù)進行深入研究。