高 琦 劉梓蘅 耿 藝 金小乂 吳嘉樂(lè) 盧雅婷張 倩 薛友林

(1遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110036;2中共遼寧省委黨校,遼寧 沈陽(yáng) 110161)

植物葉蛋白是將新鮮植物莖葉經(jīng)過(guò)壓榨后提取得到的綠色蛋白濃縮物,富含人體所需的必需氨基酸和非必需氨基酸,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[1]。植物葉蛋白是全球最多的可再生蛋白質(zhì)資源之一,其提取物和加工產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品等領(lǐng)域[2-3]。

花生是我國(guó)主要的油料作物和大量出口的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品,其總產(chǎn)量、單產(chǎn)量和出口量均位于世界前列[4]?；ㄉ谑斋@的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些副產(chǎn)物,其中花生葉中的粗蛋白含量高達(dá)20%(干重)[5]。目前關(guān)于花生葉的研究主要集中在生理方面,如Katam 等[6]對(duì)水脅迫下干旱敏感/非敏感型花生的花生葉蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)水分脅迫影響干旱敏感品種與光合作用、代謝相關(guān)蛋白的功能,在非敏感花生品種中,參與細(xì)胞壁木質(zhì)化的酶能夠誘導(dǎo)形成屏障降低葉的水分損失;Chen 等[7]對(duì)冷脅迫下花生葉的基因進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)花生葉冷應(yīng)激反應(yīng)主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和可溶性代謝物的積累等生物過(guò)程;Cossetin 等[8]對(duì)花生葉醇提取物的組成進(jìn)行了鑒定,主要檢測(cè)出29種化合物,且該提取物具有良好的抗氧化和抗炎癥活性。此外,Gao 等[9]使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)富硒的花生葉蛋白構(gòu)成進(jìn)行了鑒定,發(fā)現(xiàn)富硒后花生葉中硒的主要形式為SeMet和MeSeCys,且其抗氧化活性明顯增強(qiáng)。但關(guān)于花生葉蛋白的大規(guī)模工業(yè)化提取方法鮮有報(bào)道,若能高效地從花生葉中提取蛋白質(zhì),將會(huì)有效地促進(jìn)花生加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展,填補(bǔ)花生葉蛋白提取方法的空白。

植物蛋白提取方法種類繁多,目前常用的植物蛋白提取方法主要有堿溶酸沉法、超聲波輔助提取法[10]、直接加熱法[11]、酶輔助法提取法[12]等。堿溶酸沉法因成本低、易操作控制、可獲得較高產(chǎn)量及純度的蛋白等優(yōu)點(diǎn)已成為應(yīng)用最廣泛的方法[13-14]。因此,本試驗(yàn)采用堿溶酸沉法提取花生葉可溶性蛋白,測(cè)定其等電點(diǎn),并通過(guò)單因素試驗(yàn)考察花生葉可溶性蛋白提取工藝的主要參數(shù),以蛋白提取率作為響應(yīng)面優(yōu)化目標(biāo),對(duì)花生葉可溶性蛋白的相關(guān)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,旨在為利用花生葉開發(fā)相關(guān)新產(chǎn)品的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生葉由遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)石佛寺試驗(yàn)田提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),東京化成工業(yè)株式會(huì)社;氫氧化鈉、考馬斯亮藍(lán)G250、鄰苯三酚、水楊酸、三氯乙酸、氯化鐵等均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FA2004 電子分析天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;萬(wàn)威300型高速多功能粉碎機(jī),上海賽耐機(jī)械有限公司;LGJ-12 普通冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技有限公司;TG16G 臺(tái)式高速離心機(jī),長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;PHSJ-3F 酸堿度測(cè)試儀,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;721型可見分光光度計(jì),德卡精密量?jī)x(深圳)有限公司;TT30-DK-98-Ⅱ數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋,北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 清除花生葉表面塵土,曬干,用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80 目篩,將花生葉粉裝袋,置于4℃干燥環(huán)境貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花生葉蛋白等電點(diǎn)測(cè)定及蛋白質(zhì)提取率計(jì)算

參照金小乂[5]的方法。將酸沉pH值分別調(diào)整為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5,提取花生葉蛋白。按照公式(1)計(jì)算可溶性蛋白提取率,提取率最高的酸沉pH值即為葉蛋白等電點(diǎn)。

花生葉粉中總蛋白含量采用凱氏定氮法[15]測(cè)定。凍干樣品(花生葉可溶性蛋白提取物)中蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測(cè)定。

1.3.3 花生葉可溶性蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)純度計(jì)算 參照金小乂[5]的方法提取花生葉可溶性蛋白質(zhì),酸沉pH值調(diào)節(jié)為2.0(本試驗(yàn)測(cè)定花生葉可溶性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為2.0)。按照公式(1)計(jì)算蛋白質(zhì)提取率,按照公式(2)計(jì)算蛋白質(zhì)純度:

1.3.4 單因素試驗(yàn) 設(shè)定浸提pH值9.0、料液比1 ∶20(w/v)、浸提時(shí)間30 min為固定值,分別考察不同浸提pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、浸提時(shí)間(20、30、40、50 min)、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40(w/v)]對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率的影響。

1.3.5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件,采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[17-20]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、浸提pH值(C)3個(gè)主要影響因素為自變量,以花生葉可溶性蛋白質(zhì)提取率作為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.6 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 取2.0 mL 不同濃度的花生葉可溶性蛋白溶液(0.10、0.25、0.75、1.25和2.00 mg·mL-1)加入2 mL 0.06 mg·mL-1DPPH 乙醇溶液,避光30 min,將溶液混勻后于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[21],并與陽(yáng)性對(duì)照組Vc進(jìn)行對(duì)比。DPPH 自由基清除率按照公式(3)計(jì)算:

1.3.7 羥自由基清除能力測(cè)定 于試管中按順序加入0.5 mL 9 mmol·L-1硫 酸 亞 鐵 溶 液、0.5 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液、5.0 mL 0.02% H2O2溶液和1.0 mL 樣品溶液,混勻后將溶液置于37℃水浴中恒溫20 min,于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[22]。以純水做參比,樣品選用不同濃度的花生葉可溶性蛋白溶液(0.10、0.25、0.75、1.25和2.00 mg·mL-1),并與陽(yáng)性對(duì)照組Vc進(jìn)行對(duì)比。羥自由基清除率按照公式(4)計(jì)算:

1.3.8 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定 將4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液(0.05 mol·L-1,pH值8.2)和1.0 mL 蒸餾水混合,于25℃水浴中保溫20 min,之后迅速加入0.5 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液和1.0 mL 樣品溶液,置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min,最后加入1.0 mL 8 mol·L-1鹽酸溶液終止反應(yīng),在320 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[23]。樣品選用不同濃度的花生葉可溶 性 蛋 白 溶 液(0.10、0.25、0.75、1.25和2.00 mg·mL-1),以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。超氧陰離子自由基清除率按照公式(5)計(jì)算:

1.3.9 還原力測(cè)定 將2 mL 樣品溶液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1,pH值6.6)和2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液中,于50℃溫育20 min,然后加入1 mL 10.0%三氯乙酸,5 000 r·min-1離心10 min。取2.5 mL 上層溶液加入到0.5 mL 0.1%氯化鐵和2.5 mL 蒸餾水中,靜置10 min,于700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[24]。樣品的吸光度值越大,說(shuō)明樣品還原力能力越強(qiáng)。樣品選用不同濃度的花生葉可溶性蛋白溶液(0.10、0.25、0.75、1.25和1.50 mg·mL-1),并以Vc 作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)每組重復(fù)3次,以各組數(shù)據(jù)平均值為最終結(jié)果,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)并對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析。使用Origin Lab Origin Pro v7.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生葉可溶性蛋白的等電點(diǎn)

由圖1可知,當(dāng)酸沉pH值從1.5 上升至4.5時(shí),花生葉可溶性蛋白提取率呈先上升后下降趨勢(shì),在pH值2.0 處花生葉可溶性蛋白提取率達(dá)到最大,為44.1%,此時(shí)花生葉可溶性蛋白質(zhì)純度也最高,為61.3%。表明,花生葉可溶性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為2.0。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 花生葉可溶性蛋白的等電點(diǎn)Fig.1 Isoelectric point of peanut leaf soluble protein

2.2.1 料液比對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率的影響 由圖2-A可知,當(dāng)料液比為1 ∶10 g·mL-1時(shí),蛋白提取率較低,隨著料液比逐漸增加,花生葉可溶性蛋白提取率先上升后下降,當(dāng)料液比為1 ∶20 g·mL-1時(shí),提取率最高(47.1%),料液比為1 ∶40 g·mL-1時(shí)蛋白提取率為39.8%。這可能是由于溶劑較少時(shí)溶液的粘度大,分子的擴(kuò)散速率低,影響了物料中蛋白質(zhì)的溶解,導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能完全溶出,造成蛋白提取率較低[25-26];隨著溶劑的增加,溶液逐漸被稀釋,阻礙效果減弱,蛋白的溶出量上升,提取率升高;而當(dāng)溶劑過(guò)多時(shí)蛋白提取率下降,可能是因?yàn)檫^(guò)多的溶劑使物料在溶液中過(guò)于分散,不利于蛋白質(zhì)酸沉離心,蛋白損失增加,進(jìn)而蛋白提取率下降[27]。

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率的影響 由圖2-B可知,當(dāng)浸提時(shí)間從20 min 增加至30 min時(shí),花生葉可溶性蛋白提取率也相應(yīng)增加,浸提時(shí)間為30 min時(shí),蛋白提取率最大(47.2%);當(dāng)浸提時(shí)間大于30 min時(shí),蛋白提取率又逐漸下降,在浸提時(shí)間為50 min時(shí)蛋白提取率最低(39.2%)。浸提時(shí)間過(guò)短蛋白提取率低,可能是由于原料中蛋白還未完全溶解,導(dǎo)致溶液中蛋白含量較低,使得提取率低;而浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致浸提液中蛋白質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng),從而使蛋白質(zhì)聚集,形成沉淀,經(jīng)離心后上清液中蛋白質(zhì)含量降低,導(dǎo)致蛋白提取率降低[16,28]。

2.2.3 浸提pH值對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率的影響 由圖2-C可知,當(dāng)pH值從6.0 增加至9.0時(shí),蛋白提取率逐漸上升,在pH值9.0時(shí),蛋白提取率最大(49.3%)。這是由于堿性環(huán)境中,蛋白質(zhì)的外層結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)暴露,使得蛋白與水的結(jié)合能力增強(qiáng),蛋白質(zhì)溶解度增加,最終蛋白提取率增加;而當(dāng)pH值大于9.0時(shí),蛋白質(zhì)極性發(fā)生了變化,同時(shí)過(guò)量的堿破壞了蛋白中的肽鍵和肽鏈,導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分水解,降低了溶液中蛋白質(zhì)的含量,使得提取率降低[14,29]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

采用Design-Expert 軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,得到料液比(A)、浸提時(shí)間(B)、浸提pH值(C)的二次項(xiàng)回歸方程為:

Y= 49.70 - 0.74A+ 3.98B+ 4.00C- 0.28AB-1.76AC+2.80BC-5.01A2-2.17B2-9.35C2。

由表3可知,回歸方程中P＜0.000 1,說(shuō)明本試驗(yàn)建立的模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.66,說(shuō)明本試驗(yàn)擬合的模型純誤差不顯著;由F值可知,3個(gè)影響因素對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率影響從高到低依次為C(浸提pH值)＞B(浸提時(shí)間)＞A(料液比)?；貧w方程的R2=0.992 7 與實(shí)際情況擬合良好,試驗(yàn)誤差較小,模型成立。B、A2、B2、C2和交互作用項(xiàng)AC、BC影響極顯著(P＜0.01),說(shuō)明浸提時(shí)間、浸提pH值是影響蛋白提取率的最重要因素;而A以及AB的交互作用并不是影響蛋白提取率的顯著因素(P＞0.05)。因此,可以利用該回歸方程分析和預(yù)測(cè)花生葉蛋白提取工藝的最佳參數(shù),同時(shí)該回歸方程能有效分析和預(yù)測(cè)各因素對(duì)花生葉可溶性蛋白提取率的影響。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental results

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table3 analysis of variance for the fitted regression model

2.4 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)所得的回歸方程,利用Design-Expert 8.0.6 軟件制作交互因素的響應(yīng)面分析圖和等高線分析圖。

由圖3-A、B可知,隨著料液比的增加,蛋白提取率呈先增后降的趨勢(shì);隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白提取率呈增加趨勢(shì)。由等高線的疏密分布及響應(yīng)面的傾斜程度可知,料液比和浸提pH值的交互作用對(duì)蛋白提取率有一定的影響,且浸提時(shí)間的影響較料液比明顯,但是二者的交互作用對(duì)蛋白提取率的影響不明顯。

由圖3-C、D可知,隨著料液比的增加,蛋白提取率呈先增后降的趨勢(shì);隨著浸提pH值的升高,蛋白提取率呈先增后降的趨勢(shì)。此外,料液比和浸提pH值的交互作用對(duì)蛋白提取率影響較大,且浸提pH值的影響較料液比更明顯。表明,當(dāng)料液比介于0.05～0.55 mg·mL-1之間,浸提pH值介于9.0～9.5時(shí),蛋白提取率較高。

由圖3-E、F可知,隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白提取率呈先增后降的趨勢(shì);隨著浸提pH值的升高,蛋白提取率呈先增后降的趨勢(shì)。浸提時(shí)間和浸提pH值的交互作用對(duì)蛋白提取率影響極顯著,且浸提pH值的影響較浸提時(shí)間明顯。表明,當(dāng)浸提pH值介于9.0～9.5 之間,浸提時(shí)間約為30 min時(shí),蛋白提取率較高。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)化后花生葉可溶性蛋白最佳提取條件為浸提pH值9.27、浸提時(shí)間40 min、料液比1 ∶22(w/v),此條件下花生葉可溶性蛋白的理論提取率為52.8%?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)條件及操作的便利性,將最佳提取條件調(diào)整為浸提pH值9.0、浸提時(shí)間40 min、料液比1 ∶20(w/v)。應(yīng)用調(diào)整后的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)平行測(cè)定,得到蛋白提取率為54.2%,蛋白質(zhì)純度為63.8%,與預(yù)測(cè)值52.8%接近,結(jié)果偏差較小。說(shuō)明利用響應(yīng)面對(duì)花生葉可溶性蛋白提取條件的優(yōu)化,結(jié)果準(zhǔn)確,試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有較好的可靠性和重現(xiàn)性,所得花生葉可溶性蛋白純度較高,響應(yīng)面優(yōu)化效果較好。

2.6 花生葉可溶性蛋白抗氧化活性結(jié)果分析

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 由圖4-A可知,花生葉可溶性蛋白樣品清除DPPH 自由基效果較好,且隨著蛋白濃度的增加,DPPH 自由基清除率有較明顯的增加。當(dāng)Vc 濃度為0.25 mg·mL-1時(shí),其抑制效果達(dá)到最佳,清除率為94.0%?；ㄉ~可溶性蛋白濃度從0.1 mg·mL-1增加至0.75 mg·mL-1時(shí),DPPH 自由基清除率從18.5%增加至73.3%,DPPH 自由基清除能力有較大提升;當(dāng)?shù)鞍兹芤簼舛葹?.0 mg·mL-1時(shí)DPPH自由基消除效果最佳,清除率為90.4%。上述結(jié)果表明,花生葉可溶性蛋白與Vc 對(duì)DPPH 自由基清除率的最佳效果相當(dāng)。

圖3 料液比與浸提時(shí)間交互作用(A,B)、料液比與浸提pH 交互作用(A,C)和浸提時(shí)間與浸提pH 交互作用(B,C)的等高線和響應(yīng)面圖Fig.3 Contour line and response surface of the interaction between solid-liquid ratio and extraction time (A,B),the interaction between solid-liquid ratio and extraction pH (A,C) and the interaction between extraction time and extraction pH (B,C)

2.6.2 羥自由基清除能力 由圖4-B可知,花生葉可溶性蛋白樣品對(duì)羥自由基有一定的清除能力,隨著蛋白溶液濃度的增加,羥基自由基清除率呈上升趨勢(shì);當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.0 mg·mL-1時(shí),羥自由基清除率最高,為26.4%;而Vc 對(duì)羥自由基清除效果較好,當(dāng)其濃度為1.25 mg·mL-1時(shí),羥自由基清除率最高(94.73%)。表明,花生葉可溶性蛋白的羥自由基清除能力和Vc 有較大的差距,花生葉可溶性蛋白的羥自由基清除能力總體較弱。

2.6.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖4-C可知,花生葉可溶性蛋白樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除效果較好,且隨著蛋白濃度的增加,超氧陰離子自由基清除率增加明顯。蛋白濃度從0.1 mg·mL-1增加至0.75 mg·mL-1,超氧陰離子自由基清除率從13.9%增加至75.1%。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹? mg·mL-1時(shí),清除率達(dá)到98.4%,Vc 對(duì)超氧陰離子自由基清除率最高為98.8%。表明,花生葉可溶性蛋白與Vc 對(duì)清除超氧化物自由基的能力基本一致。

2.6.4 還原能力 由圖4-D可知,花生葉可溶性蛋白具有一定的還原能力,且葉蛋白還原能力著隨濃度的增加不斷增加,在1.5 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最高,吸光度值為1.798。Vc 有較強(qiáng)的還原能力,在1.0 mg·mL-1時(shí)還原力能力達(dá)到最高,吸光度值為2.954。表明,花生葉可溶性蛋白還原能力為Vc 還原力的一半。

3 討論

利用堿溶酸沉法提取植物蛋白,試驗(yàn)耗時(shí)短、操作便捷,是提取植物蛋白常用的方式。有研究利用堿溶酸沉法提取青稞[30]、枸杞[31]、芝麻[32]、酸棗[33]的蛋白質(zhì),并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,蛋白提取影響因素與本試驗(yàn)基本相同,但不同原料蛋白的最優(yōu)提取條件不盡相同,如青稞和酸棗最佳浸提pH值為11.0,而花生葉和枸杞最佳浸提pH值為9.0;花生葉和枸杞提取的最佳料液比為1 ∶20 g·mL-1,酸棗為1 ∶24 g·mL-1,而青稞和芝麻的最佳料液比為1 ∶25 g·mL-1。雖然不同原料最佳提取條件不同,但經(jīng)優(yōu)化后蛋白提取率均較高。出現(xiàn)這種差別的原因可能是不同原料的蛋白含量不同,相同植物不同器官之間的蛋白含量差異也較大,同一種植物的同一器官在不同生長(zhǎng)期蛋白質(zhì)含量也不同[34],從而影響蛋白提取條件。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken 試驗(yàn)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),得到最佳提取條件為浸提pH值9.0、浸提時(shí)間40 min、料液比1 ∶20 g·mL-1,該條件下進(jìn)行提取驗(yàn)證,所得蛋白提取率為54.2%,蛋白質(zhì)純度為63.8%,蛋白提取率與優(yōu)化前相比有較大提高,說(shuō)明堿溶酸沉法是一種簡(jiǎn)單方便且有效的花生葉可溶性蛋白的提取方法。但堿溶酸沉法在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中會(huì)消耗大量的酸、堿[35],浪費(fèi)資源的同時(shí)也會(huì)造成一定的酸污染,這也是該方法亟待解決的問(wèn)題。

圖4 花生葉可溶性蛋白和抗壞血酸的DPPH 自由基清除率(A)、羥自由基清除率(B)、超氧陰離子自由基清除率(C)和還原力(D)Fig.4 Antioxidant activity of peanut leaf soluble protein and Vc on DPPH free radical (A),hydroxyl radical (B),superoxide radical(C),and reducing power (D)

本試驗(yàn)通過(guò)DPPH 自由基、羥自由基清除能力等抗氧化指標(biāo)的測(cè)定,分析了花生葉可溶性蛋白的抗氧化活性。結(jié)果表明,花生葉可溶性蛋白具有良好的DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除活性,并有較強(qiáng)的還原能力。其中DPPH 自由基清除能力和還原力與Ningappa 等[36]提取的麻絞葉蛋白能力相當(dāng),但羥自由基清除能力弱于麻絞葉蛋白,這可能是因?yàn)榛ㄉ~可溶性蛋白是粗提取蛋白,樣品溶液中可能含有對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生影響的雜質(zhì),從而造成羥自由基清除活性較弱[37];DPPH 自由基和超氧陰離子自由基清除能力與陶阿麗等[38]采用閃式提取法提取的豆腐柴葉蛋白相比較強(qiáng),這可能是提取方法不同造成所提蛋白組成不同,且熱處理會(huì)降低蛋白活性,從而影響其抗氧化活性[3];超氧陰離子自由基清除能力與文靜等[39]提取的茶渣蛋白相比較弱,這可能是因?yàn)閺牟柙刑崛〉牡鞍缀谐趸锲缁?具有很強(qiáng)的自由基清除能力。此外,趙立娜等[40]利用復(fù)合蛋白酶對(duì)提取的茶渣蛋白進(jìn)行酶解,所得多肽混合物的自由基清除活性較強(qiáng),且具有良好的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力;韓雅利等[41]利用胰蛋白酶對(duì)苜蓿葉蛋白進(jìn)行酶解,酶解后的蛋白表現(xiàn)出較高的還原能力和自由基清除能力。從不同原料中提取的葉蛋白均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性,說(shuō)明它是一種良好的天然抗氧化物來(lái)源,同時(shí)酶解能夠增強(qiáng)葉蛋白的抗氧化活性。由此可見,花生葉可溶性蛋白具有一定的抗氧化活性,目前提取的花生葉可溶性蛋白是多種蛋白的混合物,有關(guān)蛋白分離、純化及其活性研究仍有待進(jìn)一步開展。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)堿溶酸沉法提取花生葉可溶性蛋白提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,得到最佳提取條件:浸提pH值9.0、浸提時(shí)間40 min、料液比1 ∶20 g·mL-1,其中浸提pH值對(duì)蛋白提取率影響最大。在最優(yōu)條件下花生葉可溶性蛋白提取率為54.2%,蛋白質(zhì)純度為63.8%。此外,花生葉可溶性蛋白表現(xiàn)出良好的抗氧化特性且與濃度存在劑量依賴性,對(duì)DPPH 自由基和超氧陰離子自由基的清除能力較強(qiáng),且具有一定的還原能力,但羥自由基清除能力較弱。花生葉蛋白的研究既能合理利用資源避免浪費(fèi),又能為花生加工產(chǎn)業(yè)提出新的發(fā)展方向。