朱宗文 田守波 楊學東 張 輝 張永平

(上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝研究所/上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201403)

輻射誘變是培育作物新品種及創(chuàng)制新種質(zhì)的一種有效方法,常用的誘變源包括60Co-γ射線、紫外線、X射線和激光等[1-3]。自20世紀90年代以來,電子束輻照已成為誘導植物變異的一種新方法。電子束輻照誘變育種是利用電子加速器產(chǎn)生的電子束處理植物種子、花粉或者植物幼苗等,從而誘導植物發(fā)生變異。電子束輻照技術能量利用率高且操作簡單[3-4],已在多種作物的誘變育種中得到較廣泛的應用。如,黃強等[5]用電子束輻照玉米自交系,獲得了較豐富的遺傳變異;林祖軍等[6]用不同劑量的電子束輻照菊花組培苗、唐菖蒲及百合種球,3種花卉在花期和花色等方面都發(fā)生了一定的變化;張容等[7]用電子束處理小麥干種子,小麥產(chǎn)生了豐富的變異類型;許競早等[8]利用高劑量電子束處理酒精酵母菌株篩選出耐高溫的菌株。目前,在番茄(Solanum lycopersicum)誘變育種中,利用電子加速器進行輻照的報道較鮮見。上海市農(nóng)業(yè)科學院番茄育種課題組曾利用電子束輻照處理番茄種子,發(fā)現(xiàn)電子束會降低種子發(fā)芽率,并對植株生物量的累積和生長形態(tài)造成一定的影響[9-11]。但是上述研究未分析電子束輻照后幼苗體內(nèi)的理化性質(zhì),且無品種間的比較。

植物在遇到逆境時會發(fā)生一系列的生理變化,如改變滲透調(diào)節(jié)和增強抗氧化酶活性等[12-13],從而減少逆境對遺傳物質(zhì)的損傷[14]。本研究選用兩個番茄品種的干種子,用不同劑量的電子束進行處理,分析輻照后種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),并進一步分析M0幼苗體內(nèi)的生理生化特性,了解電子束輻照對番茄生理特性的影響,以期為電子束誘變技術應用于番茄及其他作物的誘變育種提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄品種:黃盆栽和1479,兩品種的種子在2008年同一批次收獲,由上海市農(nóng)業(yè)科學院提供。

預試驗結(jié)果證明,同一批次的番茄種子發(fā)芽率相同,且發(fā)芽整齊度一致。

1.2 輻照處理試驗

將以上兩個番茄品種的干種子分別裝入牛皮紙袋,用電子束進行輻照處理,輻照劑量分別為200、300、400、500、600 Gy,以未輻照種子為對照。每個處理100粒種子,設3次重復。電子束處理試驗由上海市農(nóng)業(yè)科學院束能輻照技術有限公司利用日本IHI公司生產(chǎn)的ESS-010-03型電子直線加速器進行操作,額定能量10 MeV,功率10 kW。

1.3 種子發(fā)芽試驗

將經(jīng)過輻照的種子和對照種子一起在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)芽試驗,每個處理100粒種子,設3次重復。在透明塑料發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×5 cm)內(nèi)鋪2層發(fā)芽紙,把種子放在發(fā)芽紙上,保持恒溫25℃。從培養(yǎng)第3天開始,到第14天為止,每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)和幼苗生長情況。各項發(fā)芽指標計算公式如下:

式中,Nt表示在td時的發(fā)芽種子個數(shù);Dt表示相應的發(fā)芽天數(shù);N表示種子總數(shù);H表示發(fā)芽終期幼苗的高度,cm。

1.4 播種和定植試驗

將每個處理約100粒種子分別播種到無孔穴盤內(nèi),待植株長出真葉時,在不同處理間選取長勢較好、生長相對一致的植株移植于32 孔穴盤。每個處理32株。無孔穴盤所用基質(zhì)為草炭∶蛭石=2 ∶1(v/v)。

1.5 番茄幼苗各項生理指標的測定

待番茄幼苗長出6～8片葉時,選取植株上部3～5片新鮮葉片,稱取0.2 g。把葉片洗凈后置于預冷的研缽中(-20℃),加入2 mL 預冷(-20℃)的磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1,pH值7.8),在冰浴上研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入離心管中,低溫(4℃) 12 000 ×g離心20 min,取上清液用于抗氧化酶活性的測定[14]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用氮藍四唑(nitrogen blue tetrazole,NBT) 法[15],過 氧 化 物 酶(peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15],過氧化氫酶(catalase,CAT)活性測定采用紫外吸收法[16]。

對于輻照處理,選取生長發(fā)育較典型的植株,取自上向下數(shù)第4片完全展開葉測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、游離脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量。采用硫代巴比妥酸法(thiobarbiturate,TBA)[15]測定MDA含量,考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白含量,蒽酮比色法測定可溶性糖含量,磺基水楊酸法測定Pro含量[17]。以上每項生理指標的測定,每處理均設3次重復。

1.6 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件和Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束處理對番茄種子萌發(fā)的影響

黃盆栽和1479的干種子經(jīng)電子束輻照后,其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)(Gi)和活力指數(shù)(Vi)都發(fā)生了變化,但是電子束對兩品種番茄種子的影響不完全相同(表1)。對于1479,當輻照劑量為200和300 Gy時,其發(fā)芽率與CK 無顯著差異,當輻照劑量達400 Gy后,其發(fā)芽率開始顯著下降,而當輻照劑量達到600 Gy時,種子發(fā)芽率僅為CK的77.2%;同時,1479的Gi和Vi都隨著輻照劑量的增加而降低,輻照劑量達到300 Gy時,Gi和Vi均顯著低于CK;輻照劑量為600 Gy時,Gi和Vi分別為8.4和11.6,僅分別為CK的38.0%和10.2%,且Vi下降幅度大于Gi,這主要是因為輻照處理嚴重抑制了胚芽和胚根的生長。而對于黃盆栽種子,當輻照劑量為200～600 Gy時,其發(fā)芽率與CK均無顯著差異;當輻照劑量為200～400 Gy時,黃盆栽種子的Gi和Vi均顯著高于CK,而輻照劑量達到500～600 Gy時,黃盆栽種子Gi與對照無顯著差異,Vi開始顯著低于CK,且隨著輻照劑量的增加而快速降低。上述結(jié)果表明,番茄種子發(fā)芽率會隨著電子束輻照劑量的增加而降低,且兩個番茄栽培品種對電子束敏感性不同,1479 較黃盆栽更敏感。

2.2 電子束處理對番茄幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖1可知,1479和黃盆栽的種子經(jīng)電子束處理后,其幼苗葉片內(nèi)的可溶性蛋白含量明顯增加,且隨著輻照劑量的增加而增加。但2個番茄品種對電子束的反應不同。對于1479,當輻照劑量為200 Gy時,幼苗葉片中可溶性蛋白含量顯著下降,僅為CK的30.77%,繼續(xù)增加輻照劑量,其可溶性蛋白含量緩慢上升,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉中可溶性蛋白含量達到2.31 mg·g-1FW,顯著高于CK,是CK的126.92%;對于黃盆栽,當輻照劑量為200和300 Gy時,其幼苗葉片中可溶性蛋白含量與CK 無顯著差異,繼續(xù)增加輻照劑量,葉片中可溶性蛋白含量顯著增加,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉片中可溶性蛋白含量達到最大值(6.24 mg·g-1FW),顯著高于CK,是CK的183.46%。

表1 電子束處理對番茄種子萌發(fā)的影響Table1 Effects of electron beam treatment on the seed germination rate of tomato

圖1 電子束處理對番茄幼苗葉片中可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effects of electron beam treatment on the soluble protein content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束處理后,幼苗中可溶性糖含量總體呈升高趨勢(圖2)。在本試驗輻照劑量范圍內(nèi),隨著輻照劑量的增加,黃盆栽幼苗葉片中可溶性糖含量表現(xiàn)出緩慢上升趨勢,而1479 幼苗葉片中可溶性糖含量的變化比較復雜。對于1479,當輻照劑量為200 Gy時,幼苗葉片中可溶性糖含量顯著低于CK;當輻照劑量為300～500 Gy時,幼苗葉片中可溶性糖含量隨著輻照劑量的增加而增加;當輻照劑量達到500 Gy時,可溶性糖含量達到最大值(2.53 mg·g-1FW),為CK的202.4%;而當輻照劑量達到600 Gy時,其可溶性糖含量迅速下降至1.87 mg·g-1FW,為CK的149.6%。

圖2 電子束處理對番茄幼苗葉片中可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of electron beam treatment on the soluble sugar content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束處理后,其幼苗葉片中Pro含量隨輻照劑量的增加呈直線上升趨勢(圖3)。當輻照劑量為600 Gy時,兩番茄品種幼苗葉片中Pro含量都達到最大值,其中,1479 幼苗葉片中Pro含量為2.4 μg·g-1FW,為CK的338.03%;黃盆栽中Pro含量為5.32 μg·g-1FW,為CK的217.14%。

圖3 電子束處理對番茄幼苗葉片中Pro含量的影響Fig.3 Effects of electron beam treatment on the free proline content in tomato seedling

綜上,電子束處理顯著影響了番茄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量。兩番茄品種幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和Pro含量總體都隨著輻照劑量的增加呈上升趨勢,1479 幼苗葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量在低劑量(200 Gy)處理時出現(xiàn)顯著下降,而后隨著輻照劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢,而黃盆栽無此現(xiàn)象。

2.3 電子束處理對番茄幼苗葉片MDA含量和抗氧化酶活性的影響

由圖4可知,兩番茄品種種子經(jīng)過電子束處理后,其幼苗葉片中MDA含量隨輻照劑量的增加而增加。對于1479,當輻照劑量為0～300 Gy時,幼苗葉片中MDA含量隨著輻照劑量的增加而緩慢增加;當輻照劑量為400～600 Gy時,幼苗葉片中MDA含量隨著輻照劑量的增加而快速增加;當輻照劑量達到600 Gy時,其MDA含量達到最大值(6.54 μmol·g-1FW),為CK的416.56%。對于黃盆栽,當輻照劑量為0～500 Gy時,其幼苗葉片中MDA含量一直緩慢增加,當輻照劑量達到600 Gy時,幼苗葉片中MDA含量開始迅速增加,并達到最大值(7.52 μmol·g-1FW),為CK的204.91%。

圖4 電子束處理對番茄幼苗葉片中MDA含量的影響Fig.4 Effects of electron beam treatment on the MDA content in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中SOD活性也發(fā)生了明顯的變化,但兩品種呈現(xiàn)不同的變化趨勢(圖5)。當輻照劑量低于300 Gy時,1479 幼苗葉片中SOD活性隨著輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為300 Gy時,其SOD活性達到最大值(153.04 U·g-1FW),為CK的138.11%;當輻照劑量高于300 Gy后,幼苗葉片中SOD活性隨著輻照劑量的增加而逐漸降低,輻照劑量達到600 Gy時,SOD活性降為113.66 U·g-1FW,為CK的102.57%。黃盆栽種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中SOD活性隨輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為0～300 Gy時,其SOD活性增加非常緩慢;當輻照劑量為400～600 Gy時,葉片中SOD活性迅速升高,且在輻照劑量為600 Gy時達到最大值(280.31 U·g-1FW),為CK的146.50%。

圖5 電子束處理對番茄幼苗葉片中SOD活性的影響Fig.5 Effects of electron beam treatment on the SOD activity in tomato seedlings

兩番茄品種種子經(jīng)電子束輻照后,其幼苗葉片中POD活性總體呈升高趨勢,但兩品種對電子束的反應不同(圖6)。對于1479,當輻照劑量為0～300 Gy時,幼苗葉片的POD活性隨著輻照劑量的增加而升高;當輻照劑量為400 Gy時,POD活性下降,與CK 無顯著差異;當輻照劑量大于500 Gy時,POD活性又隨著輻照劑量的增加急劇上升,且在輻照劑量為600 Gy時達到最大值(77.75 U·g-1FW)。對于黃盆栽,其幼苗葉片中POD活性隨著輻照劑量的增加一直緩慢升高,輻照劑量為600 Gy時,POD活性達到最大值(51.98 U·g-1FW),為CK的142.65%。

圖6 電子束處理對番茄幼苗葉片中POD活性的影響Fig.6 Effects of electron beam treatment on the POD activity in tomato seedlings

番茄種子經(jīng)過電子束處理后,其幼苗葉片中CAT活性變化趨勢完全不一致,甚至在一定的輻照劑量范圍內(nèi),兩品種的CAT活性呈現(xiàn)相反的變化趨勢(圖7)。對于1479,當輻照劑量為0～400 Gy時,幼苗葉片中CAT活性隨著輻照劑量的增加出現(xiàn)小幅度波動;當輻照劑量為500 Gy時,幼苗葉片CAT活性降至最低值(310.28 U·g-1FW);輻照劑量增加到600 Gy時,CAT活性又急劇上升,達到最高值(376.16 U·g-1FW)。對于黃盆栽,隨著輻照劑量的增加,幼苗葉片中CAT活性總體呈降低趨勢,但輻照劑量為300 Gy時,幼苗葉片中CAT活性較CK 略有升高;當輻照劑量為600 Gy時,幼苗葉片中CAT活性降至最低值(323.46 U·g-1FW),為CK的91.02%。

圖7 電子束處理對番茄幼苗葉片中CAT活性的影響Fig.7 Effects of electron beam treatment on the CAT activity in tomato seedlings

綜上,電子束處理顯著影響了番茄幼苗MDA含量和抗氧化酶活性。兩個番茄品種MDA含量都隨輻照劑量的增加呈現(xiàn)一致的上升趨勢;隨著輻照劑量的增加,1479 幼苗葉片SOD活性呈先上升后下降趨勢,POD活性呈先上升再下降而后又上升的趨勢;CAT活性總體變化不大;而黃盆栽幼苗葉片SOD和POD活性都隨輻照劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢,CAT活性在低劑量(低于300 Gy)輻照處理時無顯著變化,在高劑量(高于300 Gy)輻照處理時呈緩慢下降趨勢。

3 討論

在輻射誘變育種過程中,適宜的輻照劑量是有效誘變的關鍵。研究表明,低劑量輻射可以促進種子萌發(fā),而過高劑量輻射會抑制種子活力[18-21]。目前關于輻照適宜劑量的研究大多集中在γ射線[18,22-23]等傳統(tǒng)的輻射方式,對電子束誘變研究較少,關于電子束適宜輻照劑量的研究更鮮見。本研究利用不同輻照劑量的電子束處理1479和黃盆栽兩個番茄品種的干種子,當電子束劑量為600 Gy時(本試驗中的最高輻照劑量),番茄種子胚的結(jié)構及種子萌發(fā)的生理過程產(chǎn)生了一定的變化,種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都顯著降低,但未達到半致死劑量。此外,兩番茄品種種子對電子束輻照處理的反應不完全相同,在高劑量電子束處理下,1479種子活力較黃盆栽種子下降幅度大,即1479種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較黃盆栽種子下降快。由此可見,黃盆栽種子抗電子束輻照能力強于1479種子,這與前人利用γ 輻射處理種子的研究結(jié)果[19-21,23]類似。

電子束輻照后,生物體的細胞膜、細胞器及遺傳物質(zhì)等都會受到不同程度的損傷[24-25],但是生物體可以通過滲誘調(diào)節(jié)在一定程度上減緩傷害。本試驗測定了番茄幼苗葉片中可溶性蛋白、可溶性糖及Pro含量,發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加,幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量都呈增加趨勢,其中Pro含量增加尤其明顯。這與前人研究結(jié)果[26-28]類似,但也有不同之處。其原因可能是電子束輻照引起了一些遺傳物質(zhì)的改變,導致相應蛋白的合成發(fā)生變化。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對于植株體本身抵抗外來逆境具有重要意義,因而在受到輻照時會發(fā)生顯著的變化。本研究中Pro含量增加最為明顯,很可能是Pro 合成及降解途徑相關酶活性發(fā)生變化導致了Pro的大量積累。因此,電子束處理不但改變了番茄種子活力,而且顯著影響了其幼苗的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

此外,植株體受到逆境脅迫時會發(fā)生膜脂過氧化,導致MDA含量的積累,造成植株體相應細胞器及一些器官的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)兩番茄品種幼苗葉片MDA含量都隨著輻照劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢,說明電子束輻照處理導致了膜脂過氧化,對細胞膜造成了一定的破壞。這與吳建慧等[26]和李杰等[29]的研究結(jié)果較為一致。電離輻射會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS 會誘導生物體內(nèi)抗氧化酶活性升高,這也在一定程度上減緩了電子束造成的傷害[30-31]。因此,番茄種子受到電子束輻照后,其幼苗體內(nèi)氧化酶活性也會相應升高[11]。本研究分析了番茄幼苗中SOD、POD和CAT 3種抗氧化酶活性的變化,發(fā)現(xiàn)當電子束輻照劑量較低時,1479 幼苗葉片中SOD和POD活性隨輻照劑量的增加而升高,而當輻照劑量較高時,這2種氧化酶活性會隨輻照劑量的增加而降低或變化無規(guī)律;對于黃盆栽,其幼苗葉片中SOD和POD活性一直隨著電子束輻照劑量的增加而升高。上述結(jié)果表明,黃盆栽抗輻射能力較強,而1479 對輻射更為敏感。但這兩個番茄品種中,幼苗葉片中CAT活性均未隨輻射劑量的增加而表現(xiàn)出特定的變化趨勢,甚至黃盆栽幼苗CAT活性隨著輻射劑量的增加而降低。這與前人研究結(jié)果[21,27]不完全一致,有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究用5種不同劑量的電子束輻照處理兩個品種的番茄種子,分析電子束處理對番茄種子萌發(fā)及幼苗生理生化的影響。結(jié)果表明,隨著電子束輻照劑量的增加,番茄種子的發(fā)芽率逐漸降低,當輻照劑量為600 Gy時,黃盆栽和1479種子發(fā)芽率分別為CK的97.2%和77.2%。此外,電子束處理使幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)出現(xiàn)大量積累,抗氧化酶活性也發(fā)生一定的變化,但不同番茄品種對電子束輻照的抗性存在差異。從種子萌發(fā)和幼苗生理生化指標的變化可知,電子束輻照處理對番茄幼苗生長的影響效果顯著,不同品種間差異顯著。因而,輻照誘變是一個復雜的過程,具有誘變的不確定性和盲目性,需要確定合適的誘變劑量和相應的檢測手段。