張世昌 鄭 江

長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖北省荊州市 434000

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)具有高度激素敏感性, 是男性泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率較高, 患者預(yù)后不良，前列腺癌的發(fā)病率和死亡率正逐年升高[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約為22個核苷酸(nt)的非編碼RNA,miRNA可通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)互補配對,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá), 導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制[2], 通過參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生理過程，對疾病發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[3]。有研究表明[4],miR-221可以調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的凋亡、生長、侵襲等多種生物過程，可能與其激活JAK/STAT信號通路有關(guān)，說明miR-221與前列腺癌的發(fā)生關(guān)系密切。

GEO數(shù)據(jù)庫[5]是物種基因表達(dá)的在線數(shù)據(jù)庫。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫獲得了數(shù)據(jù)集GSE45627[4]，該數(shù)據(jù)集包括兩種樣本，一是過表達(dá)的miR-221前列腺癌細(xì)胞樣本，二是正常表達(dá)miR-221的前列腺癌細(xì)胞樣本。通過對這兩個樣本數(shù)據(jù)的分析和比較，得到miR-221調(diào)控前列腺癌的重要靶點。對基因進(jìn)行功能富集分析、蛋白—蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)和模塊分析。本研究結(jié)果可以為以后的基礎(chǔ)實驗提供可靠的作用靶點基因。

1 材料和方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) GSE45627基因表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，研究類型為expression profiling by array，在GPL570平臺上表達(dá)(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE45627數(shù)據(jù)集為前列腺癌細(xì)胞，物種是人，其中過表達(dá)miR-221前列腺癌細(xì)胞2例(n=2)，正常表達(dá)miR-221的前列腺癌細(xì)胞2例(n=2)。

1.2 識別DEG 利用Morpheus軟件(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)制作熱圖對基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察基因表達(dá)的情況。利用在線分析工具GEO2R[6]對表達(dá)的差異基因進(jìn)行分析和篩選，篩選的條件為P<0.01和|log2FC|≥1。利用Graphpad Prism軟件制作火山圖，觀察篩選的差異基因。

1.3 差異基因功能和通路富集分析 用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行差異基因的注釋?；蚬δ芨患ǚ肿庸δ芎蜕镞^程以及細(xì)胞組分。信號通路的富集分析主要是用到KEGG數(shù)據(jù)庫，KEGG(http://www.genome.jp/)是一個包含KEGG信號通路的數(shù)據(jù)庫，用于檢查基因簇的路徑和相關(guān)功能。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的建立和模塊的分析 利用String[7]數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)的檢索工具可以檢索已知和預(yù)測的蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，并且通常用于預(yù)測分子生物學(xué)中的PPI信息。將差異基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，得到差異基因相互作用的數(shù)據(jù)。Cytoscape3.5.0(http://www.cytoscape.org/)用于顯示差異基因互作關(guān)系的結(jié)果。對PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果進(jìn)行了模塊分析，采用了與Cytoscape相關(guān)的Mcode聚類算法進(jìn)行模塊分析，模塊分析可以用來識別更多的連接基因群。

2 結(jié)果

2.1 篩選基因結(jié)果 用Morpheus軟件制作的熱圖觀察所有基因的表達(dá)情況，如圖1所示。并且鑒定了過表達(dá)miR-221前列腺癌細(xì)胞與正常表達(dá)miR-221前列腺癌細(xì)胞基因表達(dá)的差異。利用在線分析工具GEO2R篩選出108個基因，其中18個基因上調(diào)，90個基因下調(diào)，如圖2所示。

圖1 所有樣品前50個基因的表達(dá)情況

注：根據(jù)旁邊色階柱，越往下的顏色代表基因表達(dá)量下降。

圖2 所有基因的火山圖

注：紅色：上調(diào)基因，綠色：下調(diào)基因，黑色：不受調(diào)控的基因。

2.2 基因功能富集分析 篩選出來的基因大多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核。這些基因通過雙鏈RNA結(jié)合、螺旋酶活性、雙鏈DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合、單鏈RNA結(jié)合等發(fā)揮分子功能。此外，這些基因還通過參與調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應(yīng)、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控、先天免疫反應(yīng)等參與miR-221調(diào)控前列腺癌的發(fā)病過程?；蚬δ芨患治鼋Y(jié)果如圖3所示。

2.3 KEGG信號通路分析 篩選出來的基因通過單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、麻疹信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路等途徑參與了miR-221調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的過程。KEGG分析結(jié)果如圖4所示。

圖3 差異基因功能富集分析

圖4 差異基因KEGG信號通路分析

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析 基于PPI網(wǎng)絡(luò)的分析之后，在Cytoscape中識別出75個節(jié)點和2 236個相互作用關(guān)系，如圖5所示。其中相互作用關(guān)系較多的基因是中樞基因，因為相互作用關(guān)系多的基因與疾病的關(guān)系更加密切。其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β(STAT1)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、干擾素誘導(dǎo)的螺旋酶c結(jié)構(gòu)域蛋白1(IFIH1)、干擾素誘導(dǎo)的GTP結(jié)合蛋白(MX1)、干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)序列3蛋白(IFIT3)、寡腺苷酸合酶2(OAS2)、泛素樣蛋白15(ISG15)、依賴ATP的RNA解旋酶(DDX58)、鳥苷酸結(jié)合蛋白1(GBP1)、寡腺苷酸合酶1(OAS1)為前十位。 通過mcode分析，選擇了1個模塊，已經(jīng)在圖中圈出，這些基因具有一些共同的表達(dá)特征，值得我們進(jìn)一步去研究，如圖5所示。

圖5 差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

前列腺癌是一種臨床較為常見的疾病, 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜, 當(dāng)人體免疫力下降, 細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA發(fā)生異常變化后, 細(xì)胞就會不受正常調(diào)節(jié)機(jī)制控制而出現(xiàn)異常生長, 產(chǎn)生癌變[8-9]。有研究表明[9-10]，前列腺癌的發(fā)生與結(jié)核桿菌和HPV病毒關(guān)系密切。本研究對miR-221過表達(dá)調(diào)控前列腺癌細(xì)胞差異表達(dá)的基因進(jìn)行了篩選，共篩選出差異基因108個，其中18個上調(diào)基因，90個下調(diào)基因，對這些基因進(jìn)行了基因功能和信號通路的富集分析結(jié)果表明，這些基因主要的功能有與雙鏈RNA結(jié)合、雙鏈DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合、單鏈RNA結(jié)合，這些基因還通過參與調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應(yīng)、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控、先天免疫反應(yīng)，說明miR-221主要通過調(diào)控基因的這些功能，來參與前列腺癌的形成過程。這些基因主要富集在單純皰疹感染信號通路、甲型H1N1流感信號通路、Toll樣受體信號通路、乙型肝炎信號通路上，說明這些基因參與了病毒感染的調(diào)節(jié)過程。

構(gòu)建了差異之間相互關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中STAT1、IRF7、IFIH1、MX1、IFIT3、OAS2、ISG15、DDX58、GBP1、OAS1為前10個樞紐基因。STAT1是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活劑，介導(dǎo)細(xì)胞對干擾素(IFN)及其他生長因子的反應(yīng)。隨著Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，通過蛋白激酶的信號傳導(dǎo)導(dǎo)致JAK激酶的激活，磷酸化的細(xì)胞二聚體與ISGF3G/IRF-9結(jié)合形成一個復(fù)合物，稱為ISGF3轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)入細(xì)胞核。ISGF3與IFN刺激反應(yīng)元件結(jié)合，激活I(lǐng)FN刺激基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)[11]。IRF7是Ⅰ型干擾素(IFN)依賴免疫應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在對DNA和RNA病毒的天然免疫應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。Ⅰ型干擾素基因(IFN-α和IFN-β)和IFN-刺激基因(ISG)的轉(zhuǎn)錄通過與其啟動子中的干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)結(jié)合來調(diào)控。可以有效地激活I(lǐng)FN-β和IFN-α基因，并通過病毒激活的myd 88非依賴性途徑和TLR激活的MYD88依賴途徑介導(dǎo)它們的誘導(dǎo)[12]。IFIH1作為病毒核酸的細(xì)胞質(zhì)傳感器的天然免疫受體，在傳感病毒感染和包括誘導(dǎo)第Ⅰ型干擾素和促炎細(xì)胞因子在內(nèi)的一系列抗病毒反應(yīng)的活化中起重要作用。MX1作為干擾素誘導(dǎo)的GTP酶結(jié)合蛋白，具有抗病毒活性，對RNA病毒和DNA病毒均有作用，它主要的作用目標(biāo)病毒是負(fù)鏈RNA病毒和乙型肝炎病毒，作用方式通過核糖核衣殼結(jié)合和滅活[13-14]。IFIT3是干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白，可以抑制病毒復(fù)制。增強MAVS介導(dǎo)的宿主抗病毒反應(yīng)，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)抗病毒基因轉(zhuǎn)錄[15]。OAS2和OASI是干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA激活的抗病毒酶，在細(xì)胞固有抗病毒反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，它還可能在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、分化和基因調(diào)控等其他細(xì)胞過程中發(fā)揮作用[16]。ISG15作為泛素樣蛋白，它在病毒感染的天然免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，DDX58作為天然免疫受體及病毒核酸的細(xì)胞質(zhì)傳感器，在檢測病毒感染和激活一系列抗病毒反應(yīng)中起著重要作用，包括誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和促炎細(xì)胞因子[17]。GBP1在兩個連續(xù)的裂解反應(yīng)中將GTP水解成GMP。具有抗流感病毒活性。促進(jìn)氧化殺滅和提供抗菌肽自噬瘤小體，提供廣泛的宿主保護(hù)對不同的病原體類別[18]。

差異基因的深入分析有助于確定miR-221調(diào)控前列腺癌發(fā)病機(jī)制中有用的靶點和途徑。這些結(jié)果可為臨床治療靶點的研究提供理論依據(jù)。本研究篩選的中樞基因需要進(jìn)一步驗證，這可能成為未來研究的重點。