張 洲 陳 鵬 章 琴 奚士航 王 峻 王小明

1 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院肝膽外科,安徽省蕪湖市 241001； 2 皖南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院

目前胰腺癌在消化道惡性腫瘤疾病中并不少見(jiàn)，具有高度惡性，對(duì)放療和化療不敏感，使得臨床治療非常困難?；颊叩念A(yù)后也很差，5年生存率低于5%，長(zhǎng)期生存率低于15%，在歐洲和美國(guó)癌癥相關(guān)死亡人數(shù)中排名第四，俗稱“癌癥之王”[1]。由于胰腺癌患者早期癥狀不典型，早期診斷不易，大部分患者就診時(shí)已是晚期。目前，不到20%的患者在確診后進(jìn)行手術(shù)治療，手術(shù)治療患者的中位生存期僅為12.6個(gè)月，未經(jīng)外科治療的患者中位生存期僅3.5個(gè)月。即使患者得到手術(shù)根治，亦需要面對(duì)高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率的風(fēng)險(xiǎn)[2]。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200核苷酸的 RNA分子，不編碼蛋白，位于細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)[3-4]。微小RNA(MiRNA)是長(zhǎng)度為18～23bp的內(nèi)源非編碼單鏈RNA分子。他們均與胰腺癌的生物學(xué)特性有密切聯(lián)系[3-5]。因此，本研究通過(guò)對(duì)LncRNA XIST及MiRNA-101在基因?qū)用娴谋磉_(dá)分析來(lái)映射臨床病理特征，找出其中的相關(guān)性，為其在臨床上用作診斷標(biāo)記物或是分子治療靶標(biāo)提供相關(guān)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年2月—2019年4月于我院行胰腺癌手術(shù)患者共50例，術(shù)后病理均為原發(fā)胰腺癌，其中胰腺導(dǎo)管腺癌46例，腺泡細(xì)胞癌1例，導(dǎo)管黏液癌3例，男29人，女21人，根據(jù)TNM標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期2例，Ⅱ期24例，Ⅲ期24例。所有患者在術(shù)前均未行任何化放療治療。

1.2 材料 TRIzol RNA分離試劑為賽默飛公司產(chǎn)品、RNA提取所需化學(xué)試劑均來(lái)自Biosharp公司，西格瑪?shù)蜏馗咚匐x心機(jī)。PCR引物合成由廣州銳博生物科技有限公司提供，所有實(shí)驗(yàn)試劑盒(逆轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增試劑盒)均購(gòu)自寶生物(Takara)公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA：提取收集50例患者術(shù)中切除的腫瘤組織及癌旁組織塊(1.0cm×1.0cm×1.0cm)置于冷凍管中并儲(chǔ)存在液氮中(25例為手術(shù)切除的腫瘤組織，25例為手術(shù)切除的癌旁組織)。每例各取腫瘤組織標(biāo)本200mg，癌旁組織200mg作為對(duì)照，均在液氮中勻漿器研磨后將組織樣品按200mg加入1ml Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管。以12 000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去沉淀，每個(gè)試管中加入200μl氯仿，并蓋上管。用手搖動(dòng)15s，在室溫下靜置10min，在4℃下以12 000轉(zhuǎn)/min離心14min，并吸出上層水相。移至另一個(gè)新的離心管中，每1ml Trizol加入0.6ml異戊醇，混合并靜置5～10min。然后，在4℃下以12 000轉(zhuǎn)/min離心4min，棄去上清液，每個(gè)試管再加入1ml 75%乙醇，輕輕搖動(dòng)混合物以懸浮沉淀物，獲得總RNA。

1.3.2 LncRNA XIST、MiRNA-101表達(dá)水平檢測(cè)：在Microtube管中配制加入 LncRNA XIST、 MiRNA-101引物的總 RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，變性和退火在 PCR機(jī)上在65℃下進(jìn)行5min和4℃以獲得變性和退火的反應(yīng)溶液。離心片刻后，將模板RNA /引物等的混合物收集在Microtube管底。將5×PrimeScriptTM緩沖液的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液加入上述 Microtube管中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在 PCR機(jī)上在以下條件下于40℃進(jìn)行15min或95℃進(jìn)行5min，反應(yīng)完成后4℃冷卻；使用PCR擴(kuò)增試劑盒，將得到的cDNA分別加樣，上機(jī)行Real time-PCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2min；95℃ 15s，60℃ 1min，循環(huán)45次；之后95℃變性1min，將其冷卻至55℃，記錄ct值以計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用Graphpad Prism7.0及SPSS22.0，測(cè)得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，無(wú)序數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料及有序計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分比(%)表示，采用秩和檢驗(yàn)：檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織LncRNA XIST表達(dá)差異與臨床病理特征相關(guān)性 在本次研究收集標(biāo)本中，LncRNA XIST表達(dá)量2-ΔΔct>1.5的有34例， LncRNA XIST表達(dá)量增高與腫瘤組織學(xué)分化具有負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)脈管侵犯、腫瘤位置大小、浸潤(rùn)深度及TMN分期等無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.2 胰腺癌組織MiRNA-101表達(dá)差異與臨床病理特征相關(guān)性 在本研究收集標(biāo)本中，MiRNA-101表達(dá)量2-ΔΔct>1.5的有29例，MiRNA-101表達(dá)量增高與腫瘤的大小、浸潤(rùn)深度及TMN分期具有負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)脈管侵犯、腫瘤位置、腫瘤組織學(xué)分化等無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 胰腺癌患者臨床病理特征與LncRNA XIST及MiRNA-101表達(dá)相關(guān)性

3 討論

迄今，胰腺癌其發(fā)病機(jī)理尚未徹底闡明，導(dǎo)致臨床治療常常舉步維艱，患者5年生存率非常低且發(fā)病率居高不下。胰腺癌的早期癥狀不明顯，且相當(dāng)多的患者在就診時(shí)已進(jìn)入晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)且長(zhǎng)期預(yù)后不良[6]。因此，早期發(fā)現(xiàn)對(duì)于改善胰腺癌患者的臨床預(yù)后和延長(zhǎng)生存期至關(guān)重要[7]。

LncRNA XIST是X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本(X-inactive specific transcript, Xist)，可以特異性地結(jié)合X染色體中的特定位點(diǎn)，介導(dǎo)X染色體失活[8-9]。目前已知MiRNA的序列結(jié)構(gòu)在各個(gè)物種間具有高度的進(jìn)化保守性[10]。MiRNA與下游靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)和相關(guān)分子信號(hào)通路的活性，參與胰腺癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程[11]。筆者認(rèn)為胰腺癌的發(fā)生與原癌基因的失活到致癌基因的激活有關(guān)，再追溯到原癌基因中某一編碼基因的某個(gè)位點(diǎn)被沉默致使不再發(fā)揮編碼蛋白的作用， LncRNA XIST在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，從本次臨床相關(guān)性研究來(lái)看，腫瘤組織學(xué)分化低的標(biāo)本與LncRNA XIST的表達(dá)密切相關(guān)，LncRNA XIST可能有助于胰腺癌的發(fā)展及更進(jìn)一步的惡性程度轉(zhuǎn)變。更進(jìn)一步分析，本次研究結(jié)果顯示MiRNA-101表達(dá)量高的標(biāo)本其腫瘤浸潤(rùn)深度及臨床分期均較樂(lè)觀，推測(cè)MiRNA-101可能是胰腺癌的抑癌基因，并為L(zhǎng)ncRNA XIST的靶基因之一，受LncRNA XIST的調(diào)控且抑制其在胰腺癌腫瘤組織中的表達(dá)，致使腫瘤組織更進(jìn)一步的增殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。本次研究并不能發(fā)掘LncRNA XIST、MiRNA-101之間是否存在相互關(guān)聯(lián)共同作用于胰腺癌，尚待進(jìn)一步研究分析。然而，也許LncRNA XIST表達(dá)增高是胰腺癌分化不良的危險(xiǎn)因素，MiRNA-101表達(dá)量降低是胰腺癌增殖、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，LncRNA XIST和MiRNA-101在一定程度上與胰腺癌的分化和發(fā)展存在相關(guān)聯(lián)系，有望作為診斷性標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)而應(yīng)用于臨床。