林寶妹， 洪佳敏， 邱珊蓮， 鄭開(kāi)斌， 張 帥

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，福建漳州 363005)

嘉寶果(MyrciariacaulifloraBerg.)，又名珍寶果、樹(shù)葡萄、擬愛(ài)神木，為桃金娘科(Myrtaceae)擬愛(ài)神木屬(Myrciaria)常綠灌木，是原產(chǎn)巴西的一種常見(jiàn)果樹(shù)，現(xiàn)在我國(guó)臺(tái)灣省、福建省、廣東省等多個(gè)地區(qū)均有種植[5]。果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含多種維生素及微量元素，例如維生素B2、抗壞血酸(維生素C)、鋅、鈣、鐵等[6]。果皮富含花青素、單寧、黃酮醇等酚類化合物，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、消炎、抗菌等多種生物活性[7-10]。目前已有多種嘉寶果果實(shí)加工品如果酒、果醬、果脯等在售，市場(chǎng)前景較好。目前對(duì)嘉寶果果皮抗氧化活性的研究主要是果皮粗提物或者直接應(yīng)用果皮凍干粉，而對(duì)果皮粗提物的分離及抗氧化活性組分進(jìn)行篩選的研究較少。本研究采用不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)嘉寶果果皮提取物進(jìn)行分級(jí)，通過(guò)測(cè)定總多酚含量并以清除DPPH·自由基、ABTS+自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基對(duì)各極性部位的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為嘉寶果果皮的研究與利用提供理論基礎(chǔ)與方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

嘉寶果成熟果實(shí)采自福建省龍海市惠昌嘉寶果專業(yè)合作社，供試嘉寶果品種為“沙巴”。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：L5S型，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)；超純水機(jī)：UPW-20N型，北京歷元電子儀器有限公司生產(chǎn)；分析天平：BS110S型，德國(guó)Sartorius集團(tuán)生產(chǎn)；粉碎機(jī)：WBL2521H型，佛山美的集團(tuán)生產(chǎn)；數(shù)控超聲波清洗儀：KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；冷凍高速離心機(jī)：MIKRO-22R型，德國(guó)Hettich生產(chǎn)；臺(tái)式冷凍恒溫振蕩儀，THZ-C-1型，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.3 嘉寶果果皮提取物不同極性部位制備

1.3.1 嘉寶果果皮提取物制備 嘉寶果成熟果實(shí)去籽和果肉→嘉寶果果皮→60 ℃烘干至恒質(zhì)量→粉碎，過(guò)40目篩→提取溶劑70%乙醇、料液比 1 g ∶60 mL、28 ℃、180 r/min振蕩提取20 h→28 ℃、120 W超聲波提取20 min→8 000 r/min離心15 min→取上清液待用。

1.3.2 不同極性部位制備 取“1.3.1”節(jié)制備的提取液→50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至無(wú)醇味→以超純水稀釋濃縮液至原提取液體積→依次以乙酸乙酯、正丁醇按照1 ∶1體積比萃取3次→合并萃取液→40～65 ℃ 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑→獲得乙酸乙酯相、正丁醇相以及萃取后剩下的水相，重新溶解各極性部位，以原材料質(zhì)量濃度表示各極性部位質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.4 總多酚含量測(cè)定

參考Wang等的福林酚法[11]，并修改如下：將不同極性部位提取物用超純水稀釋成10 mg/mL，取0.1 mL樣品于試管中，再加入0.1 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu試劑和2.8 mL水，混勻，靜置8 min后加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，搖勻，室溫下密封避光2 h，于765 nm處測(cè)吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次。按照上述方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸，繪制回歸曲線。不同極性部位提取物的總多酚含量以1 g原材料含有的沒(méi)食子酸質(zhì)量計(jì)，單位為mg/g。

1.5 抗氧化能力測(cè)定

1.5.1 DPPH·清除能力 參照Tang等的方法[12]并稍作修改，具體如下：分別取0.5 mL樣品于試管中，再加4.5 mL 0.13 mmol/L DPPH·的95%乙醇溶液，搖勻后置于暗處反應(yīng)30 min，于 517 nm 處測(cè)定吸光度D1；同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組D0(以超純水代替樣品)和樣品本底組D2(以95%乙醇代替DPPH·溶液)，試驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值，計(jì)算DPPH·清除率。按照上述方法測(cè)定維生素C對(duì)DPPH·的清除率。

DPPH·清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.2 ABTS+清除能力 參照Seczyk等的方法[13]并稍作修改：配制ABTS+反應(yīng)工作液，7 mmol/L ABTS+與2.45 mmol/L過(guò)硫酸銨等體積混合，暗處?kù)o置12 h，以95%乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.05，為反應(yīng)工作液。取0.1 mL樣品于試管中，加入 3.8 mL ABTS+反應(yīng)工作液，搖勻后置于暗處反應(yīng) 6 min，于734 nm處測(cè)定吸光度D1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組D0(以超純水代替樣品)和樣品本底組D2(以95%乙醇代替ABTS+反應(yīng)工作液)，試驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值，計(jì)算ABTS+清除率。按照上述方法測(cè)定維生素C對(duì)ABTS+的清除率。

ABTS+清除率=[1-(D1-D2)/D0]×100%。

1.5.3 ·OH清除能力 參考劉曉飛等的方法[14]，并稍作修改，具體如下：2 mL pH值7.4的磷酸鹽緩沖液和0.5 mmol/L鄰二氮菲70%乙醇溶液、0.5 mmol/L 硫酸亞鐵、樣品各1 mL依次加入試管中，再加入1 mL 0.1%過(guò)氧化氫溶液，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后于510 nm處測(cè)定吸光度D1，同時(shí)設(shè)置損傷組D2(以超純水代替樣品)、未損傷組(以超純水代替過(guò)氧化氫溶液和樣品)D0，樣品本底組D3(以超純水代替反應(yīng)試劑)試驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值，計(jì)算·OH清除率。按照上述方法測(cè)定維生素C對(duì)·OH的清除率。

·OH清除率=[1-(D1-D2-D3)/(D0-D2)]×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行回歸曲線的制作；采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同質(zhì)量濃度沒(méi)食子酸測(cè)得的吸光度建立回歸方程：y=1.668x+0.079(r2=0.995 5)，由圖1可見(jiàn)，沒(méi)食子酸在質(zhì)量濃度0.100～0.500 mg/mL 內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.2 果皮提取物不同極性部位總多酚含量

由圖2可見(jiàn)，嘉寶果果皮粗提液不同極性部位總多酚含量在5.895～41.287 mg/g，其含量從高到低依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位的總多酚含量較為接近，乙酸乙酯部位總多酚含量為(41.287±0.421) mg/g，正丁醇部位的總多酚含量為(36.211±0.240) mg/g，水部位含量最低，為(5.895±0.092) mg/g，水部位僅約為乙酸乙酯部位多酚含量的1/8。

2.3 果皮提取物不同極性部位抗氧化能力

2.3.1 DPPH·、ABTS+、·OH清除能力 由圖3、圖4、圖5、表1可知，在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，果皮提取物各極性部位對(duì)DPPH·、ABTS+、·OH等3種自由基的清除作用隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng)，二者呈線性關(guān)系，r2>0.98。且各極性部位對(duì)以上3種自由基的清除能力相差較小，回歸曲線斜率相近，EC50值較為接近，但仍有以下區(qū)別：正丁醇部位和乙酸乙酯部位對(duì)DPPH·、ABTS+、·OH 自由基的清除能力大小順序依次均為DPPH·>ABTS+>·OH，而水部位對(duì)以上自由基的清除能力大小順序?yàn)镈PPH·>·OH>ABTS+，即水部位清除·OH的能力大于清除ABTS+。清除DPPH·、ABTS+、·OH 自由基能力大小依次為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位。表1、表2結(jié)果表明，抗氧化劑(維生素C)對(duì)DPPH·和ABTS+自由基的清除能力大于各極性部位，但清除·OH自由基的能力弱于乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

表1 嘉寶果果皮提取物不同極性部位自由基清除效果的比較

注：―表示在試驗(yàn)條件下未測(cè)得。

表2 維生素C清除 等4種自由基效果的比較

2.4 抗氧化與總多酚含量的相關(guān)性

表3 抗氧化與總多酚含量的相關(guān)性

注：*表示達(dá)顯著相關(guān)(P<0.05)；**表示達(dá)極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

正常情況下人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于動(dòng)態(tài)平衡中。適當(dāng)數(shù)量的自由基不但對(duì)人體無(wú)害，而且參與體內(nèi)能量傳遞、炎癥消除、抑制腫瘤等重要過(guò)程。自由基的數(shù)量過(guò)多，會(huì)破壞機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，干擾正常代謝活動(dòng)，與糖尿病、心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。除機(jī)體自身的自由基清除系統(tǒng)如抗氧化酶、維生素、激素等，許多天然產(chǎn)物中富含的小分子如維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素以及各種多酚等均能有效清除自由基，幫助人體抵御過(guò)量自由基造成的危害，對(duì)這些天然產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化功能評(píng)價(jià)，有利于天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嘉寶果果皮醇提取物能有效清除DPPH·、·OH及ABTS+等自由基，表現(xiàn)出較好的抗氧化性，但未對(duì)果皮醇提取物進(jìn)行分部位有效性研究。

本研究以嘉寶果果皮為原料，以不同極性有機(jī)溶劑依次萃取果皮醇提取物獲得提取物乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。通過(guò)4種不同方法檢測(cè)各極性部位的抗氧化活性并測(cè)定其多酚含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各極性部位中以乙酸乙酯部位抗氧化活性最強(qiáng)，總多酚含量最高，清除·OH的能力甚至超過(guò)了維生素C，表現(xiàn)出極強(qiáng)的羥自由基清除能力，具有抗氧化劑開(kāi)發(fā)價(jià)值。本研究結(jié)果可為今后嘉寶果果皮多酚的開(kāi)發(fā)利用提供一定的參考。