周 勇， 代小瑩， 劉 昔， 龔明福， 劉 忠， 曾建威

(1.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000； 2.峨眉山生物多樣性保護(hù)與利用研究所，四川樂山 614000；3.眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川眉山 620010； 4.四川省樂山市經(jīng)濟(jì)作物站，四川樂山 614000)

菊果膠桿菌(Pectobacteriumchrysanthemi)屬軟腐果膠桿菌屬(Pectobacterium)，是魔芋軟腐病主要致病菌之一[1]。與菊歐文氏菌(Dickeyadadantii)和菊歐文氏桿菌(Erwiniachrysanthemi)相比，菊果膠桿菌對魔芋軟腐病的致病性更強(qiáng)[2]。目前，魔芋軟腐病主要采用化學(xué)方法進(jìn)行防治，鐘艷紅等研究了農(nóng)用殺菌劑對魔芋軟腐病的防治效果，發(fā)現(xiàn)用農(nóng)用鏈霉素、噻菌銅、葉枯唑、噻唑鋅等殺菌劑對種芋進(jìn)行處理或在發(fā)病初期噴施對防治魔芋軟腐病有顯著效果，其中農(nóng)用鏈霉素防治法被普遍認(rèn)為是魔芋軟腐病防治的主要方法[3-7]。生防菌對魔芋軟腐病致病菌也具有顯著的抑制作用，如枯草芽孢桿菌的30%硫酸銨鹽析蛋白對胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[8]；密旋鏈霉菌與肉質(zhì)鏈霉菌及其制劑對菊果膠桿菌、菊歐文氏菌和菊歐文氏桿菌具有明顯的抑菌效果，在混合接種情況下相對防效最高可達(dá)100%[9]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥材提取液對某些植物病害致病菌也具有抑菌作用，如烏梅-五倍子混合液對蝴蝶蘭軟腐病病原菌有顯著的抗菌作用[10]，白花蛇舌草、金錢草、丹參和甘草配伍對細(xì)菌和霉菌抑菌效果最好[11]，五倍子對芒果炭疽菌和蒂腐菌抑菌活性最高[12]，大蒜的乙酸乙酯提取物對番茄早疫菌具有較好的抑菌活性[13]，但未見利用中藥材對魔芋軟腐病致病菌進(jìn)行抑菌研究的報(bào)道。本試驗(yàn)選取10種具有抗菌殺毒作用的中藥材和大蒜，制備提取液對魔芋軟腐病主要致病菌菊果膠桿菌進(jìn)行抑菌效果研究，旨在探討中藥材對魔芋軟腐病的抑菌效果及機(jī)制，探索魔芋軟腐病的生物防治新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為由樂山師范學(xué)院微生物研究室分離鑒定的魔芋軟腐病致病菌菊果膠桿菌(P.chrysanthemi)。

供試藥材為黃連、黃芩、烏梅、百部、五倍子等10種中藥材及大蒜(表1)。

表1 供試藥材特性與來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中藥材及大蒜提取液的制備

取經(jīng)粉碎的中藥材10 g，加80%乙醇50 mL，35 ℃、150 r/min 恒溫振蕩提取48 h后，室溫下 4 000 r/min 離心 6 min，提取母液，并編號，5 ℃暗處儲存?zhèn)溆?。鮮蒜在室溫粉碎后，放入28 ℃培養(yǎng)箱酶解30～60 min，然后加入乙酸乙酯在28 ℃、130 r/min 振蕩提取12 h，提取母液，標(biāo)記后于5 ℃暗處儲存?zhèn)溆谩?/p>

提取效率(mL/g)=提取母液量/稱取中藥材的量。

1.2.2 病原菌菌懸液的制備 將活化的菊果膠桿菌斜面在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)18 h，用無菌水將菌苔洗下，稀釋為濃度107～108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3 提取液抑菌效果測驗(yàn)

1.3.1 母液抑菌效果測定 吸取制備的0.1 mL菌懸液加入牛肉膏蛋白胨瓊脂平板(直徑9 cm)中央，均勻涂布，室溫下干燥5 min，取直徑1 cm的無菌濾紙片，分別浸入6 mL藥液中40 min后，移入已涂布病菌的平板中，每個(gè)平板均勻放置4張濾紙片，30 ℃ 培養(yǎng)24 h，用直尺測定抑菌圈直徑(包含濾紙片直徑)，計(jì)算每個(gè)平板的抑菌圈平均直徑，以抑菌圈的大小表示抑菌能力的強(qiáng)弱，并用80%乙醇搖床24 h處理作為空白對照(CK)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同濃度提取液抑菌效果測定 選取“1.3.1”節(jié)中抑菌效果最好的3種提取液，按二倍稀釋法進(jìn)行稀釋，稀釋成5個(gè)梯度，按“1.3.1”節(jié)的方法進(jìn)行抑菌效果測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)資料整理在Excel 2010軟件中進(jìn)行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在DPS 7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件中進(jìn)行，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法(SSR法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液抑菌效果

由表2、圖1可知，在供試的10種中藥材和大蒜提取液中，有6種中藥材對菊果膠桿菌具有明顯的抑菌作用，不同的中藥材提取液對菊果膠桿菌抑菌效果差異較大。其中黃連、大蒜提取液抑菌效果最好，平均抑菌圈直徑分別為2.27、2.19 cm，極顯著優(yōu)于其他藥材及對照；黃芩提取液抑菌效果次之，平均抑菌圈直徑為1.68 cm，顯著優(yōu)于百部、金銀花，極顯著優(yōu)于對照，烏梅、柴胡也極顯著優(yōu)于對照；白芷平均抑菌圈直徑與對照存在顯著差異，具有一定的抑菌效果；而百部、金銀花、板藍(lán)根、金櫻子、五倍子對菊果膠桿菌無明顯抑制作用。從提取效率看，抑菌效果較好的黃連、大蒜和黃岑具有較高的提取效率，1 g可以提取2.23～3.40 mL，經(jīng)濟(jì)性較好。

2.2 提取液稀釋后抑菌效果

選取對菊果膠桿菌抑菌效果較好的黃連、黃芩和大蒜提取液分別按二倍稀釋法稀釋成5個(gè)梯度濃度進(jìn)行抑菌效果測定，結(jié)果(表3)表明，抑菌效果在不同稀釋倍數(shù)間、 不同藥材間差異均較大。稀釋后的提取液抑菌效果均顯著或極顯著下降，黃連和大蒜提取液稀釋后抑菌效果極顯著下降，黃芩在稀釋2～8倍時(shí)，抑菌效果顯著下降，稀釋16倍及以上時(shí)抑菌效果極顯著下降。

表2 10種中藥材和大蒜提取液對菊果膠桿菌的抑菌效果比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平差異顯著。下表同。

由表4可知，稀釋后黃連2倍稀釋液抑菌效果最好，極顯著優(yōu)于其他藥材稀釋液，其平均抑菌圈直徑為1.83 cm；黃芩2倍、4倍稀釋液和黃連4倍稀釋液仍然具有明顯的抑菌作用，抑菌效果顯著優(yōu)于對照；當(dāng)黃連、黃芩稀釋倍數(shù)達(dá)到8倍及以上時(shí)，抑菌效果與對照無顯著差異。抑菌效果由大到小依次為黃連2倍稀釋液>黃芩2倍稀釋液>黃芩4倍稀釋液>黃連4倍稀釋液。大蒜提取液母液抑菌效果較好，且優(yōu)于除黃連母液外的其他中藥材，但是一旦稀釋后使用，基本喪失對菊果膠桿菌的抑菌作用。

表3 不同稀釋倍數(shù)對3種中藥材提取液抑菌效果的影響

3 討論與結(jié)論

細(xì)菌性病害是植物病害中較為頑固的一類病害，其防治一直是生產(chǎn)上的難點(diǎn)，尋找有效防治藥物是細(xì)菌性病害防治的關(guān)鍵措施[14]。魔芋軟腐病是由菊果膠桿菌、菊歐文氏菌、菊歐文氏桿菌等感染的一類細(xì)菌性病害，對魔芋生產(chǎn)構(gòu)成了極大威脅[2]。目前，生產(chǎn)上對魔芋軟腐病的防治常采用鏈霉素等抗生素和噻菌銅等化學(xué)農(nóng)藥，抗生素的長期使用必然會造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用不僅使病菌逐漸產(chǎn)生抗藥性，還會增加環(huán)境中的農(nóng)藥殘留[15]。因此，開發(fā)環(huán)境友好、防效顯著的防治藥物是目前魔芋軟腐病防治的研究熱點(diǎn)。中藥材作為天然的抑菌藥物，其抗菌、低毒、無副作用、不會產(chǎn)生殘留等特點(diǎn)和優(yōu)勢，在現(xiàn)代預(yù)防和控制細(xì)菌感染方面發(fā)揮了積極作用。由于中藥的特殊性，細(xì)菌較少對中藥產(chǎn)生耐藥性[11]。現(xiàn)有研究表明，中藥材對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌、芒果炭疽菌和蒂腐菌、蝴蝶蘭軟腐病病原菌具有較好的抑菌作用[10-12，16]。黃連小檗堿、黃連堿及藥根堿已被證實(shí)對白色念珠菌[17]、放線菌門和厚壁菌門細(xì)菌[18]、大腸桿菌[19]具有較強(qiáng)的抑菌作用；黃芩有效成分對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等均有抑菌活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥材黃連、黃芩的醇提取液對菊果膠桿菌具有極顯著的抑菌作用，且具有較高的提取效率(2.23～2.87 mL/g)，可作為制備防治魔芋軟腐病的生物農(nóng)藥的材料，為魔芋軟腐病防治提供一條新的途徑，為中藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

表4 3種中藥材提取液在不同的稀釋倍數(shù)下抑菌效果比較