賀 雄， 丁朝輝， 胡立冬， 任佐華， 周 瑚，3， 朱華珺，3， 李俊俊， 丁宇倩， 戴良英，3， 劉二明，3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；2.湖南省桃江縣農(nóng)業(yè)局，湖南益陽 413400；3.南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128)

水稻稻瘟病是由稻梨孢絲狀真菌(有性態(tài)為Magnaportheoryzae，無性態(tài)為Pyriculariaoryzae)侵染引起，是一種水稻災(zāi)害性病害[1]。選育和推廣高效的抗病品種，是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、最有效、最安全的方法[2]。選育和推廣抗病品種，不僅對稻瘟病有優(yōu)良的防治效果，而且能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低生產(chǎn)成本，減少壞境污染；但是，同一個抗病品種大面積種植所形成的選擇壓極易導(dǎo)致稻瘟病菌發(fā)生變異，產(chǎn)生新的生理小種，從而使推廣的水稻抗病品種在3～5年就可能喪失抗病性[2-3]。因此，不斷監(jiān)測稻瘟病菌的變異程度與水稻抗性品種的抗病性，及時篩選新的抗性品種對稻瘟病的防治十分重要[4]。

稻瘟病菌與水稻品種之間的特異性互作符合Flor的“基因?qū)颉奔僬f[5]。本研究利用10株具有代表性的已知無毒基因的稻瘟病菌單孢菌株，對湖南種植的48個水稻品種進(jìn)行抗瘟性評價(jià)和抗瘟基因型進(jìn)行初步鑒定，以期為湖南水稻栽培品種合理布局防控稻瘟病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2017年于湖南省桃江縣稻瘟病病圃采集多個水稻品種稻瘟病樣，通過多倍變焦體視顯微鏡挑取單孢，分離得到49個稻瘟病單孢菌株后經(jīng)無毒基因鑒定篩選出具有代表性的菌株10株(表1)。

1.2 供試水稻

供試水稻共48個品種(由湖南省益陽市桃江縣植保站統(tǒng)一收集提供)，對照為筆者所在課題組繁殖的高感品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)(表2)。

1.3 孢懸液制備及水稻育苗

利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基將保藏于高粱粒中的稻瘟病菌單孢菌株活化后，再將其接種到番茄燕麥培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28 ℃光暗交替培養(yǎng)(光—暗周期為12 h—12 h)，待稻瘟病菌菌絲長滿整個平板后，加入1 mL無菌水，用滅菌棉棒將表面菌絲刮斷，再用移液槍將洗脫的菌液轉(zhuǎn)移到新的番茄燕麥培養(yǎng)基上，并用涂布器涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)至新的番茄燕麥培養(yǎng)基平板上長滿菌絲，再用含0.1% Tween-20 的無菌水洗脫孢子，并利用血球計(jì)數(shù)板將孢懸液的孢子濃度調(diào)節(jié)至2×105個/mL，供接種使用[6]。

表1 10株供試菌株包含的無毒基因

表2 48個供試水稻品種及對照

表2(續(xù))

水稻育苗土壤為肥沃的稻田土，置于育苗盤(30 cm×20 cm×7 cm)備用。種子在室溫下用清水浸泡24 h，瀝干水分再置于恒溫箱32 ℃催芽12 h至種子破胸露白，28～30 ℃催芽24 h，至芽長約 0.2 cm，播種到育苗盤；在秧苗1葉1心、3葉1心、接種前3 d各追施尿素1次，每次每盤施尿素1 g。

1.4 離體接種

當(dāng)水稻苗長至5葉期，剪取葉片，進(jìn)行針刺離體接種[6]。接種后的稻苗置于28 ℃、濕度為95%的環(huán)境中暗處理24 h，隨后光暗交替(光—暗周期為12 h—12 h)培養(yǎng)，期間隨時觀察發(fā)病情況，4～6 d后記錄發(fā)病情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

稻瘟病菌群體的毒力頻率(virulence frequency，VF)=對測試水稻品種有毒力的菌株數(shù)/所有菌種菌株數(shù)×100%；當(dāng)VF≥70%時病菌群體表現(xiàn)強(qiáng)毒力，50%≤VF<70%時為較強(qiáng)毒力，20%≤VF<50%時為中等毒力，VF<20%時為弱毒力[7]。

接種葉片上僅有黑褐色壞死斑或沒有病斑時為抗病反應(yīng)型；當(dāng)病斑中央灰褐色、病斑比較大并有黃色發(fā)病圈時為感病反應(yīng)型。通過數(shù)據(jù)分析軟件DPS 7.05，利用0-1 Nei & Li最長聚類法進(jìn)行聚類分析[8]。并根據(jù)10株菌株對已知抗性基因的24個近等基因系水稻品種的接種鑒定結(jié)果，對供試水稻品種進(jìn)行抗瘟基因的推導(dǎo)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株稻瘟病單孢菌株對48個水稻品種的毒力分析

利用已明確其無毒基因的10株稻瘟病單孢菌株對48個水稻品種進(jìn)行苗期離體接種試驗(yàn)。結(jié)果表明，10株供試菌株接種于48個不同水稻品種后，各品種表現(xiàn)出的抗病能力存在較大差異，其對應(yīng)的毒力頻率在0～60%之間(表3)。在48個水稻品種中，表現(xiàn)出較強(qiáng)毒力的品種有豐兩優(yōu)4號(VF=60%)、粵禾絲苗(VF=50%)、隆兩優(yōu)534(VF=50%)，以上3個品種抗譜窄，在湖南地區(qū)種植抗稻瘟病效果較差，應(yīng)避免在湖南稻瘟病多發(fā)地區(qū)種植；有34個水稻品種毒力頻率為中等毒力(20%≤VF<50%)，占試驗(yàn)總數(shù)的70.83%，此34個水稻品種抗譜較廣，抗稻瘟病效果一般，具有一定的抗病能力，但是隨著時間的推移，有抗病能力衰減甚至喪失的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)慎重使用；屬弱毒力(VF<20%)的水稻品種共有11個，占試驗(yàn)總數(shù)的22.92%，其中徽兩優(yōu)882、豐兩優(yōu)香1號毒力頻率甚至低至0，這種現(xiàn)象可能是由于本試驗(yàn)菌株數(shù)量太少造成，此11個水稻品種抗性基因譜寬，抗病效果強(qiáng)，可結(jié)合水稻品種產(chǎn)量、氣候等各方面因素進(jìn)行推廣種植。

表3 10株稻瘟病菌株對48個水稻品種的毒力頻率

2.2 48個供試水稻品種抗瘟基因型分類

根據(jù)48個水稻品種與10株已知無毒基因的稻瘟病菌株的親和反應(yīng)類型結(jié)果，利用DPS 7.05數(shù)據(jù)軟件建立0-1數(shù)據(jù)庫，并通過0-1 Nei & Li最長聚類法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.70，即差異系數(shù)0.30水平上，可將48個水稻品種劃分為31類(圖1)。

統(tǒng)計(jì)每一類別內(nèi)水稻品種表現(xiàn)抗性所關(guān)聯(lián)的菌株，從而推導(dǎo)出供試水稻品種所含有的抗瘟基因譜(表4)，結(jié)果表明，本試驗(yàn)的48個供試品種抗病性都比較強(qiáng)(圖2)，抗瘟基因Pi-1、Pi-a、Pi-7、Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19等普遍存在于各水稻譜系中，出現(xiàn)頻率高；Pi-5、Pi-t、Pi-kp抗瘟基因出現(xiàn)頻率比較低；抗性基因Pi-ta出現(xiàn)頻率最低。

表4 48個水稻品種抗性基因類別推定

表4(續(xù))

3 討論與結(jié)論

實(shí)踐證明控制水稻稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的手段就是選育和利用抗病品種。近年來，我國各地區(qū)、各級種子管理和評審部門對參試水稻品系的稻瘟病抗性嚴(yán)格把控，使得新審定品種均能在中抗以上水平上得到改善[9]。但由于稻瘟病生理小種多、變化速度快、致病力差異大等原因，新品種在推廣種植3～5年后，抗性就會逐漸喪失[10]。

本研究利用10株已知所含無毒基因的稻瘟病單孢菌株對湖南稻區(qū)栽培的48個水稻品種進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，表現(xiàn)高抗水平的品種有11個，分別是徽兩優(yōu)882、吉優(yōu)353、榮優(yōu)390、T優(yōu)259、益優(yōu)701、兩優(yōu)6206、徽兩優(yōu)絲苗、豐兩優(yōu)香1號、湘兩優(yōu)143、N兩優(yōu)2號、創(chuàng)兩優(yōu)茉莉占，中等抗病品種34個，感病品種3個。農(nóng)技部門在篩選主導(dǎo)品種時，應(yīng)結(jié)合最新的鑒定結(jié)果，重點(diǎn)推廣農(nóng)藝性狀較好的中、高抗稻瘟病水稻品種。

水稻中存在著一類編碼NBS-LRR蛋白(nucleotide binding site-leucine-rich repeats)的主效抗稻瘟病基因， 這類抗病基因介導(dǎo)的抗性表現(xiàn)強(qiáng)烈，傳統(tǒng)意義上稱之為垂直抗性[11]。在育種應(yīng)用上，抗性基因可操作性強(qiáng)、效果明顯，因此開展主效抗性基因的鑒定及其應(yīng)用研究較多。隨著抗性基因數(shù)量的增加，供試材料的抗病性呈上升趨勢。品種抗瘟能力與其抗稻瘟病基因型種類密切相關(guān)，不同的抗病基因型能針對不同的生理小種產(chǎn)生抗稻瘟病反應(yīng)[12]。

大量與水稻稻瘟病鑒定與抗性基因型的推定研究當(dāng)中，李剛等利用14個菌株鑒定江蘇省49個水稻品種抗性基因，抗性基因Pi-a、Pi-k的出現(xiàn)頻率比較高，達(dá)到將近80%[13]。宋兆強(qiáng)等利用抗瘟基因Pi-b、Pi-ta、Pi-54和Pi-km的功能標(biāo)記檢測了60個育種資源，得出Pi-b、Pi-ta在各水稻品種中出現(xiàn)的頻率雖然比較高，但是該抗瘟基因抗性逐漸在減弱[14]。周瑚等利用16株含已知無毒基因的稻瘟病單孢菌株對湖南地區(qū)栽培的50個水稻品種進(jìn)行了稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明，出現(xiàn)頻率最高的抗性基因?yàn)镻i-k和Pi-20，其次為Pi-t、Pi-ta、Pi-z和Pi-3；抗瘟基因Pi-5和Pi-19的出現(xiàn)頻率低于20%[15]。

本研究基于2018年湖南稻區(qū)多個水稻品種分離的稻瘟病菌株鑒定主要抗瘟基因，其中Pi-5、Pi-t、Pi-kp等抗瘟基因出現(xiàn)頻率稍低，抗瘟基因Pi-ta出現(xiàn)頻率最低；主要體現(xiàn)在金兩優(yōu)383、T兩優(yōu)168、中早-39、豐兩優(yōu)四號、荊兩優(yōu)1189這些水稻品種的抗性基因缺失，導(dǎo)致抗瘟性差，選育時應(yīng)慎重。杜太宗等在對Pi1、Pi9聯(lián)合抗病性的研究中發(fā)現(xiàn)，抗性基因Pi1、Pi9二者共同作用，能夠抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種，拓寬抗譜，提高水稻抗病性[16]。未來在進(jìn)行抗稻瘟病育種時，可把多個抗病基因聚合在一起，這將是獲得持久、高抗稻瘟病品種的重要途徑之一。