周淼平， 張增艷， 姚金保， 王化敦， 楊學(xué)明， 張 鵬， 余桂紅， 馬鴻翔

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇南京 210014； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 10081)

小麥紋枯病是一類重要的世界性小麥病害，主要由禾谷絲核菌等侵染小麥莖稈基部引起，造成病苗死苗、花稈爛莖，嚴(yán)重時產(chǎn)生枯白穗，導(dǎo)致減產(chǎn)，該病害在我國長江中下游麥區(qū)和黃淮麥區(qū)頻繁發(fā)生，每年造成數(shù)億元的經(jīng)濟損失[1]，培育和應(yīng)用抗紋枯病小麥品種無疑是防治該病害最經(jīng)濟有效的途徑。常規(guī)抗病品種的培育需要有抗性穩(wěn)定的抗源用于配制雜交組合，近30年來，我國研究人員對3 000余份小麥種質(zhì)材料進行了紋枯病抗性鑒定，但未篩選到免疫和高抗材料[2]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥對紋枯病的抗性是一數(shù)量性狀，目前已對部分抗源的抗病數(shù)量性狀座位(quantitative trait locus，QTL)進行分子定位，但這些QTL對紋枯病抗性的解釋率低，要明顯提高小麥的紋枯病抗性須累積多個抗性QTL，因而對小麥抗紋枯病的分子標(biāo)記輔助聚合育種帶來諸多困難[3]。

植物基因工程技術(shù)為提高小麥的紋枯病抗性提供了新的途徑，通過引入外源抗病基因或提高內(nèi)源抗病基因的表達等方法可以增強小麥對紋枯病菌的抵御能力。目前，采用該方法已經(jīng)獲得一批抗紋枯病的種質(zhì)材料，進一步拓寬了小麥紋枯病抗源的范圍。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所張增艷實驗室采用基因芯片分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了參與小麥抵御紋枯病菌侵染的重要基因TaAGC1(TaPK-R1)，該基因?qū)儆贏GC蛋白激酶，將該基因連接組成型啟動子并導(dǎo)入大面積推廣品種揚麥20中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因T2代植株的紋枯病抗性較受體對照揚麥20有顯著提高[4-5]。但該基因的組成型表達對小麥其他農(nóng)藝性狀如生育期、產(chǎn)量以及籽粒性狀等有無影響尚不清楚。本研究對篩選獲得的4個穩(wěn)定的T7代轉(zhuǎn)基因株系在大田環(huán)境下與受體對照揚麥20的農(nóng)藝性狀進行比較，評價TaPK-R1基因的組成型表達對轉(zhuǎn)基因株系生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因株系PK372、PK394、PK465和PK495由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所張增艷研究員提供；受體對照揚麥20由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所麥類作物研究室提供。

1.1.2 試劑與儀器 Karroten植物基因組DNA提取試劑盒，購自南京翼飛雪生物科技有限公司；目的基因PCR檢測試劑、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量分析試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。試驗所用TP350PCR儀以及TP960熒光定量PCR儀，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1TaPK-R1基因的檢測 在拔節(jié)期對4個轉(zhuǎn)基因株系和對照揚麥20各取5株葉片，分別混樣，冷凍干燥磨碎后參照植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊提取DNA，導(dǎo)入的TaPK-R1基因采用嵌合引物進行擴增，正向引物序列 PK-3F為5′-CATCTAAGGCGGGTCCAT-3′，反向引物序列NOS-2R為5′-AACCCATCTCATAAATAACG-3′。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，含10×buffer 2 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、10 μmol/L引物1.0 μL、50 ng模板DNA、1 UTagDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.2TaPK-R1基因的表達分析 在拔節(jié)期對4個轉(zhuǎn)基因株系和對照各取5株葉片，分別混樣，液氮冷凍磨碎，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR?Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒推薦方法進行熒光定量PCR。Actin基因為內(nèi)參基因，其特異引物對為TaActin-F(5′-C A C T G G A A T G G T C A A G G C T G-3′)和TaActin-R(5′-C T C C A T G T C A T C C C A G T T G-3′)；TaPK-R1基因特異引物對為TaPK-R1-Q-F(5′-T T T G G A G A G G T G C G T C T T T G T-3′)和TaPK-R1-Q-R(5′-A G G A G G T T T C T T T C G G C T T T G-3′)。熒光定量PCR在TaKaRa TP960熒光定量PCR儀上進行，PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果計算相對表達量。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀分析 供試材料于2017年11月28日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合轉(zhuǎn)基因基地(118°38′47″E、32°28′26″N)播種，對照和每個轉(zhuǎn)基因株系按隨機小區(qū)種植，每個小區(qū)5行，行長 5 m，行距0.25 m，3次重復(fù)。播種后按正常小麥管理。

田間試驗主要對轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育和形態(tài)特征等主要農(nóng)藝性狀進行觀察記載，包括播種期、出苗期、抽穗期、開花期和成熟期等生育期；基本苗、高峰苗、有效穗數(shù)、株高、產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀以及轉(zhuǎn)基因株系對白粉病、紋枯病和赤霉病等病害的抗性。成熟時，考察主穗穗長、小穗數(shù)、不孕小穗數(shù)以及每穗粒數(shù)的變化。收獲后，測量籽粒大小、千粒質(zhì)量、籽粒蛋白含量和籽粒硬度等籽粒性狀。籽粒大小測量方法：每小區(qū)隨機取100粒籽粒，照相后采用SmartGrain軟件根據(jù)像素計算籽粒長度與寬度；籽粒蛋白含量采用Perten DA7200近紅外儀測定；籽粒硬度測量方法：每小區(qū)隨機取200粒籽粒，采用Perten SKCS4100單粒籽粒硬度測定儀測定，計算平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)的方差分析和檢驗分析均采用Excel 2016軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因株系TaPK-R1基因的檢測結(jié)果

此次種植的轉(zhuǎn)基因株系已經(jīng)是T7代，在拔節(jié)期取轉(zhuǎn)基因株系和對照葉片，提取DNA，采用嵌合引物對目的基因TaPK-R1進行PCR檢測，結(jié)果(圖1)表明轉(zhuǎn)基因株系均能擴增出886 bp的目的條帶，說明導(dǎo)入的TaPK-R1基因已經(jīng)整合進小麥基因組并能穩(wěn)定遺傳。

2.2 轉(zhuǎn)基因株系TaPK-R1基因的表達分析結(jié)果

在拔節(jié)期同時取轉(zhuǎn)基因株系和對照葉片，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再采用熒光定量PCR檢測TaPK-R1基因的表達，以受體對照揚麥20為基準(zhǔn)，計算相對表達量，結(jié)果(圖2)表明轉(zhuǎn)基因株系PK372、PK394、PK465、PK495的TaPK-R1基因表達量分別是對照的9.0、8.9、9.2、5.9倍，說明導(dǎo)入的目的基因不僅可以正常表達，而且表達量較對照有較大提高。

2.3 轉(zhuǎn)基因株系農(nóng)藝性狀評價

2.3.1 生長發(fā)育部分階段的物候期比較 由于播種時間較正常播種期有所推遲，從播種到出苗的時間延長，但轉(zhuǎn)基因株系與對照沒有差別，說明TaPK-R1基因的組成型表達沒有影響種子的萌發(fā)能力。抽穗后氣溫較高，生育期進程加快，轉(zhuǎn)基因株系與對照相似，全生育期有所縮短，兩者幾乎沒有區(qū)別(表1)。

表1 轉(zhuǎn)基因小麥生長發(fā)育各階段物候期的比較

2.3.2 苗情和產(chǎn)量的比較 與受體對照揚麥20相似，轉(zhuǎn)基因株系也屬春性小麥，幼苗半直立，株型松散。在基本苗基本一致的情況下，轉(zhuǎn)基因株系的高峰苗數(shù)和有效穗數(shù)與對照差異不顯著，說明TaPK-R1基因的組成型表達沒有對小麥的繁茂性和成穗率產(chǎn)生影響。4個轉(zhuǎn)基因株系的產(chǎn)量均較對照有所降低，但差異沒有達到顯著水平。由于播種推遲，生長期縮短，轉(zhuǎn)基因株系和對照的株高較往年有較大降低，轉(zhuǎn)基因株系與對照也未出現(xiàn)顯著差異(表2)。

表2 轉(zhuǎn)基因小麥部分重要農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表3、表4、表5同。

2.3.3 主穗性狀的比較 成熟時每個小區(qū)隨機取10株主穗，考察主穗農(nóng)藝性狀，結(jié)果(表3)表明轉(zhuǎn)基因株系的主穗長度、小穗數(shù)、不孕小穗數(shù)和粒數(shù)與受體對照相比均無顯著差異。

2.3.4 籽粒性狀的比較 籽粒收獲曬干后，每小區(qū)隨機取100粒測定籽粒長度和寬度，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系籽粒的長寬雖有所變化，但與對照相比差異不顯著。采用近紅外測定籽粒蛋白含量發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系籽粒蛋白含量較對照有所提高，但未達到顯著差異水平。籽粒硬度測定結(jié)果與之相仿，轉(zhuǎn)基因株系籽粒硬度比對照稍高，但也沒有顯著差異，同屬于軟質(zhì)麥。千粒質(zhì)量的分析結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)基因株系與對照差異不顯著(表4)。

對轉(zhuǎn)基因株系和對照的病害調(diào)查顯示，在整個生育期內(nèi)小麥黃花葉病沒有發(fā)生，白粉病和銹病只有輕微發(fā)生，兩者差異不明顯。但后期紋枯病和赤霉病的危害情況有顯著差異，揚麥20平均紋枯病病情指數(shù)達到50.7%，而轉(zhuǎn)基因株系只有30.7%～36.7%；赤霉病方面，轉(zhuǎn)基因株系的病級要低于對照，普遍率也是同樣的趨勢(表5)，說明TaPK-R1基因的組成型表達不僅提高了小麥對紋枯病的抗性，對赤霉病的抗性也有所提高，可能TaPK-R1是激酶基因，該基因參與了小麥抗病的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)了下游抗病基因的表達，從而提高了小麥對病害的基礎(chǔ)抗性。

3 討論與結(jié)論

序列和結(jié)構(gòu)分析表明，TaPK-R1，屬于AGC蛋白激酶家族，該家族是植物蛋白激酶的一個亞家族，家族內(nèi)的激酶均包含C端的絲氨酸/蘇氨酸特異性的催化結(jié)構(gòu)域。在哺乳動物中，AGC蛋白激酶是細(xì)胞生長、新陳代謝和細(xì)胞死亡的重要調(diào)節(jié)因子，但在植物中AGC蛋白激酶的功能還不是十分清楚。在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)39個AGC蛋白激酶成員，根據(jù)其激酶催化結(jié)構(gòu)域的變化可將它們分為6個亞族，但只有少數(shù)幾個AGC蛋白激酶基因的功能得到解析，分別參與植物生長激素的調(diào)節(jié)、根毛發(fā)育以及藍光信號和活性氧信號的傳導(dǎo)。

表4 轉(zhuǎn)基因小麥籽粒性狀的調(diào)查結(jié)果

表5 轉(zhuǎn)基因小麥紋枯病和赤霉病抗性表現(xiàn)

目前參與植物病害防御的AGC蛋白激酶基因除了TaPK-R1(TaAGC1)基因外，報道的只有3個基因分別在擬南芥、水稻和番茄中的功能被解析。如擬南芥的OXIDATIVESIGNAL-INDUCIBLE1(AtOXI1)蛋白激酶基因?qū)δＪ接|發(fā)免疫(PTI，PAMP triggered immunity)和效應(yīng)蛋白觸發(fā)免疫(ETI，effector triggered immunity)等植物免疫反應(yīng)均有正調(diào)控作用[6]。在水稻中，Matsui等發(fā)現(xiàn)了與AtOXI1蛋白激酶基因同源的OsOxi1基因，研究結(jié)果表明該基因?qū)λ静『剐云鹫{(diào)控作用，過表達OsOxi1基因可以增強水稻對稻瘟病(Magnaportheoryzae)的抗性，OsOxi1基因主要通過對OsPti1a的磷酸化，解除OsPti1a對水稻基礎(chǔ)抗性的負(fù)調(diào)控作用，從而提高水稻的基礎(chǔ)抗性[7]。番茄的細(xì)菌性斑點病主要由番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pseudomonassyringaepv. Tomato)侵染引起，番茄的Pto激酶基因可以識別病原菌菌株種類，從而產(chǎn)生AvrPto效應(yīng)物，加強番茄對病原菌侵染的抵抗。Devarenne等研究發(fā)現(xiàn)，一種屬于AGC Ⅷa的蛋白激酶AvrPto-dependentPto-interactingprotein3(Adi3)可能參與Pto基因的抗病過程，Adi3基因?qū)λ拗骷?xì)胞的程序性死亡起負(fù)調(diào)控作用，Pto/AvrPto可與Adi3互作，造成病原菌侵染的宿主細(xì)胞死亡，從而增加宿主對病原菌的抗性[8]。本研究進一步證實TaPK-R1基因可以提高小麥的抗病性，組成型表達TaPK-R1轉(zhuǎn)基因小麥的紋枯病和赤霉病抗性都得到明顯提高。

研究表明，在轉(zhuǎn)基因小麥中組成型表達TaPK-R1基因沒有對小麥的生育期、生長習(xí)性、產(chǎn)量性狀、穗部性狀、株高和籽粒性狀產(chǎn)生明顯的影響。