(貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

甜櫻桃(Prunusavium)又名歐洲甜櫻桃，大櫻桃，屬薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)櫻桃亞屬(Cerasus)植物[1]。甜櫻桃因其鮮艷的外觀和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而深受人們喜愛，種植面積和產(chǎn)量也因此逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，在2007—2016年間，全球櫻桃生產(chǎn)呈上升趨勢，2016年種植面積達(dá)43.97萬hm2，產(chǎn)量達(dá)231.80萬t，而10年前年產(chǎn)量僅32.71萬t[2]。盡管全球櫻桃產(chǎn)量劇增，但中國仍較低，2016年產(chǎn)量僅3.75萬t，與產(chǎn)量排名全球第一的土耳其相差甚遠(yuǎn)，尚不能滿足國民的需求[2]。

實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)是一種用于研究基因表達(dá)水平的技術(shù)，常用于驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性以及不同實驗條件下特定基因的表達(dá)情況等[3]。qRT-PCR技術(shù)因其高通量、高靈敏度以及較好的特異性和重復(fù)性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于研究動植物及微生物的基因功能[4-5]。由于不同樣本在RNA質(zhì)量、產(chǎn)量、cDNA第一鏈合成效率以及擴(kuò)增效率上的差異會影響qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，通常用內(nèi)參基因?qū)ζ鋽?shù)據(jù)進(jìn)行校正[6]。內(nèi)參基因通常是組織或器官中一些表達(dá)相對恒定的持家基因[7]，但并不是所有持家基因均可以作為內(nèi)參基因。因此，需根據(jù)具體實驗需要，對不同組織[7]、不同實驗條件[8]或不同發(fā)育時期[9]進(jìn)行內(nèi)參基因篩選。

因地域和氣候的不同，甜櫻桃花芽發(fā)育過程中一些花芽發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)可能會發(fā)生變化，進(jìn)而可影響花粉和雌蕊的發(fā)育。而這些花器官的發(fā)育則影響果實的發(fā)育，最終影響甜櫻桃產(chǎn)量。因此研究花芽發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)情況對提高甜櫻桃產(chǎn)量具有重要意義。為保證花芽發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)情況檢測的準(zhǔn)確性，需對花芽不同發(fā)育時期的內(nèi)參基因進(jìn)行篩選。為篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究根據(jù)課題組前期果實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(尚未發(fā)表)，從中選取表達(dá)相對穩(wěn)定，表達(dá)量較高且常作為其他物種內(nèi)參基因的10個持家基因(28SrRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18SrRNA、RSP3、CYP40、ACT2、α-TUB3)作為候選內(nèi)參基因，以2個甜櫻桃品種3個發(fā)育時期花芽為材料，用qRT-PCR技術(shù)對這10個候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，并結(jié)合GeNorm[10]、NormFinder[11]、BestKeeper[12]3種軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評價，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，以期為甜櫻桃花芽發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)模式研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以貴州省威寧縣(E：104.12，N：27.25)種植的甜櫻桃桑提娜和修文縣(E：106.21，N：26.45)種植的甜櫻桃黔櫻一號不同發(fā)育時期花芽為材料。根據(jù)花芽長度分為3個發(fā)育時期，第一時期花芽大小為0.5～0.6 cm，第二時期為0.8～0.9 cm，第三時期為1.1～1.2 cm;黔櫻一號3個發(fā)育時期樣本分別為Q 1、Q 2、Q 3,桑提娜3個發(fā)育時期樣本分別為S 1、S 2、S 3;每個樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

實驗前將經(jīng)高溫滅菌后的研缽、藥匙等經(jīng)液氮冷卻，樣品在液氮浸潤下進(jìn)行研磨。研磨后的樣品使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP 441)進(jìn)行總RNA提取。隨后用20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用Multiscan GO (Thermo)檢測RNA的濃度和純度。隨后以RNA為模板，用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 候選內(nèi)參基因篩選和引物設(shè)計

根據(jù)本實驗室建立的甜櫻桃桑提娜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)報道的常用內(nèi)參基因，選取10個持家基因為候選內(nèi)參基因，用引物設(shè)計軟件Primer Primer 5.0設(shè)計特異性引物(表1)，并將設(shè)計好的引物提交至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 普通PCR和qRT-PCR

候選內(nèi)參基因的普通PCR擴(kuò)增在Veriti 96 well PCR儀(Applied Biosystems)上進(jìn)行，以2個品種不同發(fā)育時期花芽的cDNA為模板，反應(yīng)體系共10μL:ddH2O 3.5μL，2×Taq PCR Mastermix (201 T)，正、反向引物(10μmol·L-1)各 0.5μL，cDNA 0.5μL。PCR 擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，58.4～61.3 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶是否單一，以確定該引物的特異性。

候選內(nèi)參基因的qRT-PCR反應(yīng)在實時熒光定量 PCR儀(CFXconnect)上進(jìn)行,反應(yīng)體系(10μL)為:cDNA模板0.5μL，正向引物0.25μL，反向引物0.25μL，SYBR Select Master Mix 5μL，ddH2O 4μL。所用程序為:94 ℃ 10 min;94°C 15 s，58.4～61.3 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，39個循環(huán);72 ℃ 2 min。

1.5 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評價

分別用Genorm、NormFinder軟件和Bestkeeper軟件對候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評價。其中Genorm和NormFinder穩(wěn)定值越低，表明該基因表達(dá)越穩(wěn)定。Bestkeeper分析結(jié)果中標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)、相關(guān)系數(shù)R值和變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)是主要參考指標(biāo)，SD和CV越小，R值越大，則該基因表達(dá)越穩(wěn)定;當(dāng)SD>1時，則該基因表達(dá)不穩(wěn)定。最后，通過計算各候選內(nèi)參基因的幾何平均值進(jìn)行排名，幾何平均值越小，說明越穩(wěn)定，反之則越不穩(wěn)定。

表1 甜櫻桃不同發(fā)育時期花芽候選內(nèi)參基因qRT-PCR引物及擴(kuò)增效率

圖1 甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期總RNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測

注:M為DNA Maker 2000;1為28S rRNA;2為EF1-a1;3為EF1-a2;4為UBC；5為RPL13;6為18S rRNA;7為RSP3;8為CYP40;9為ACT2;10為α-TUB3。圖2 10個內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度及完整性驗證

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，RNA完整性好，無基因組DNA污染(圖1)，且所有樣本OD260/OD280介于1.8～2.1之間，OD260/OD230介于1.8～2.2之間，表明所有樣本RNA完整，純度高，可用于進(jìn)行后續(xù)實驗。

以桑提娜第一時期的花芽cDNA為模板對10個候選基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)顯示只有單一的條帶，沒有出現(xiàn)引物二聚體及非特異擴(kuò)增的現(xiàn)象，通過測序、比對證實擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的基因序列信息一致。

2.2 擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性分析

用候選內(nèi)參基因的引物，以6個樣本的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，每個樣本3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)，并將獲得的數(shù)據(jù)用LinRegPCR軟件[13]進(jìn)行計算。結(jié)果顯示，候選內(nèi)參基因的R2較高，均可達(dá)0.99以上，擴(kuò)增效率介于87.67%～101.50%之間(表1)，滿足qRT-PCR對引物擴(kuò)增效率的要求。另外，所有候選內(nèi)參基因的溶解曲線均顯示為單一信號峰，且同一樣品重復(fù)性好。

表2 BestKeeper分析10個候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

Ct值是指基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增時到達(dá)預(yù)設(shè)的閾值時所需的循環(huán)數(shù)[14]，循環(huán)數(shù)越小代表起始基因的模板濃度越高。基于此，分析了10個候選內(nèi)參基因在各樣本中的Ct值，并對其表達(dá)豐度進(jìn)行評估。本研究中，候選內(nèi)參基因的Ct值介于19～31之間，表達(dá)豐度分布范圍廣(圖3)。其中，以EF1-a2、RPL13和RSP3的Ct值在不同樣本間變化較小，數(shù)據(jù)較為集中。因此，初步判斷在甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期，EF1-a2、RPL13和RSP3表達(dá)較為穩(wěn)定。為了更準(zhǔn)確地判斷內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，后續(xù)還需用內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價軟件做進(jìn)一步分析。

圖3 10個候選內(nèi)參基因Ct值的箱形圖

2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

GeNorm是以Ct值為原始數(shù)據(jù)，通過計算各候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M來衡量其表達(dá)穩(wěn)定性。軟件默認(rèn)當(dāng)候選內(nèi)參基因的M值大于1.5時，不適于作為內(nèi)參基因。M值越小，越穩(wěn)定，越適合作為內(nèi)參基因，反之則不適合作為內(nèi)參基因。經(jīng)比較，按M值由高到低的順序排列依次為:18SrRNA>ACT2>α-TUB3>RPL13>28SrRNA>CYP40>EF1-a1>UBC>EF1-a2=RSP3。另外，10個候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，以18SrRNA最大，為1.014;EF1-a2和RSP3最小，均為0.340，表明這些候選內(nèi)參基因均適合作為內(nèi)參基因。其中EF1-a2和RSP3最佳，其次為UBC、EF1-a1、CYP40、28SrRNA、RPL13、α-TUB3;相對而言，18SrRNA和ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定。此外，GeNorm還通過計算配對變異值Vn/n+1來確定最適宜的內(nèi)參基因個數(shù)。該程序以0.15為閾值，當(dāng)Vn/n+1<0.15時，表明最適合的內(nèi)參基因有n個。GeNorm計算結(jié)果表明，V2/3為0.110，小于0.15，表明最適合的內(nèi)參基因有2個。

NormFinder是以Ct值為原始數(shù)據(jù)，計算出表達(dá)穩(wěn)定性值M，根據(jù)M值的大小判斷其是否適合做內(nèi)參基因，判斷標(biāo)準(zhǔn)為M值越小，越適合作為內(nèi)參基因，反之則不適合作為內(nèi)參基因。經(jīng)計算，UBC和CYP40表達(dá)穩(wěn)定值最小，分別為0.164和0.196，即表達(dá)穩(wěn)定性最好;而18SrRNA和ACT2的表達(dá)穩(wěn)定值最大，分別為1.251和0.819，說明18SrRNA和ACT2表達(dá)穩(wěn)定性最差(圖4)。因此UBC和CYP40最適合作為內(nèi)參基因，其次是RSP3和EF1-a1。

圖4 NormFinder分析10個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

BestKeeper分析則主要通過內(nèi)參基因的Ct值計算得到的SD和CV值來確定不同處理、不同發(fā)育時期下候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。分析結(jié)果(表2)表明，EF1-a2和RSP3SD值最小，均為0.40，說明這2個內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，最適合作為內(nèi)參基因，其次是RPL13、UBC和CYP40。

2.5 穩(wěn)定性綜合分析

經(jīng)綜合分析，甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低依次為:EF1-a2>RSP3>UBC>CYP40>EF1-a1>RPL13>28SrRNA>α-TUB3>ACT2>18SrRNA;由排名可以看出，EF1-a2和RSP3為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

為驗證本研究所篩選的EF1-a2、RSP3基因的穩(wěn)定性，用生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因AUX1和ARF對篩選的內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行驗證。以EF1-a2、RSP3及EF1-a2+RSP3作為內(nèi)參基因，對2個甜櫻桃品種花芽發(fā)育過程中AUX1基因和ARF基因進(jìn)行表達(dá)分析時發(fā)現(xiàn)，AUX1和ARF在EF1-a2、RSP3及EF1-a2+RSP3標(biāo)定下表達(dá)趨勢均一致(圖5)，可見EF1-a2和RSP3的穩(wěn)定性較好。綜上所述，一致選定EF1-a2和RSP3桑提娜和黔櫻一號為甜櫻桃不同發(fā)育時期花芽qRT-PCR分析基因表達(dá)的最佳內(nèi)參基因。

圖5 不同內(nèi)參基因標(biāo)定下甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期AUX1、ARF基因表達(dá)量

3 討 論

研究表明，內(nèi)參基因的選擇不具有通用性，如盲目地使用內(nèi)參基因，很可能會降低定量結(jié)果的精確性，甚至得出錯誤的結(jié)論[15]。因此，在對目標(biāo)基因進(jìn)行表達(dá)情況分析前，須對內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評價?；谵D(zhuǎn)錄組測序篩選內(nèi)參基因是一種有效的方法[16-17]，可為后續(xù)驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究基因表達(dá)情況提供技術(shù)和線索。且在櫻桃[18]，蓮霧[19]，菊葉薯蕷[9]等多種植物中取得了成功[18]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在不同的品種、不同實驗條件、不同組織、不同時期下均穩(wěn)定表達(dá)。但實際上，并不存在這樣理想化的內(nèi)參基因[20]。且有研究指出，內(nèi)參基因的表達(dá)量在不同的生理狀態(tài)和細(xì)胞類型中表達(dá)并非絕對穩(wěn)定[21]。

為了更準(zhǔn)確的探究2個甜櫻桃品種不同發(fā)育時期花芽中相關(guān)基因的表達(dá)情況，本研究對2個甜櫻桃品種不同發(fā)育時期的花芽進(jìn)行了內(nèi)參基因篩選。GeNorm和BestKeeper分析表明，EF1-a2和RSP3表達(dá)最穩(wěn)定，表明EF1-a2和RSP3是最適合的內(nèi)參基因。Normfinder的分析結(jié)果顯示，最穩(wěn)定的為UBC和CYP40?？梢?，3種軟件分析的結(jié)果其穩(wěn)定性排序略有差異，推測是3個統(tǒng)計學(xué)軟件算法的不同所致[22]。但3個軟件所分析的穩(wěn)定性排名前5名的內(nèi)參基因中均有EF1-a2和RSP3，且經(jīng)綜合排序分析表明，EF1-a2和RSP3是最穩(wěn)定的2個內(nèi)參基因。另外，GeNorm分析內(nèi)參基因的配對變異系數(shù)結(jié)果表明，2個內(nèi)參基因就可滿足校正目的基因的表達(dá)量[23-24]。經(jīng)多種分析方法證明后，用生長素運輸載體AUX1和生長素響應(yīng)因子ARF對其進(jìn)行驗證，結(jié)果表明該2個基因表達(dá)趨勢一致，說明EF1-a2和RSP3適合作為甜櫻桃花芽發(fā)育過程中的內(nèi)參基因。

在動植物體內(nèi)，ACT基因編碼的肌動蛋白，在維持細(xì)胞基本生理活動方面發(fā)揮著重要的作用，因此常被作為內(nèi)參基因。在對柑橘[25]、核桃[26]、荔枝[27]等果樹進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價時，actin基因均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。但在本研究中，3種軟件的分析結(jié)果均顯示ACT2基因在甜櫻桃花芽中較不穩(wěn)定，這可能與物種，組織或發(fā)育時期有關(guān)。在百合[28]、擬南芥[15]、馬鈴薯[29]和石蒜[30]等的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)ACT基因不適合作內(nèi)參基因。類似地，18SrRNA在動植物整個生命活動中起著重要作用，在對楊樹[18]，柑橘[31]，水稻[32]進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價時，均發(fā)現(xiàn)18SrRNA適合作為內(nèi)參基因。但在本研究中，18SrRNA表達(dá)豐度雖然較高，但在不同的樣本中表達(dá)豐度跨度較大、極不穩(wěn)定，不適合作為甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期的內(nèi)參基因，其原因可能是不同發(fā)育時期的花芽中rRNA與mRNA的比例在不斷變化所致[33];另外，RNA小量的降解對mRNA表達(dá)水平的影響可能要比18SrRNA的影響大[34]。因此，在實驗過程中，需使用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因來增加試驗的準(zhǔn)確性及可信度，為后續(xù)獲得相對準(zhǔn)確的基因表達(dá)分析結(jié)果奠定基礎(chǔ)。

在對蘋果[6]、桃[35]、葡萄[36]等果樹進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價研究時，篩選出了UBQ、ACTB、Fe-SOD、GAPDH、EF1-a和SAND等幾個相對穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，但不同果樹中均有差異。本研究所選取的10個候選內(nèi)參基因均參與生物體的基本生化代謝過程，在所有細(xì)胞和生理狀態(tài)下都能較穩(wěn)定地表達(dá)。經(jīng)GeNorm、NormFinder和BestKeeper三個內(nèi)參基因穩(wěn)定性軟件評估后，發(fā)現(xiàn)EF1-a2和RSP3最適合作為內(nèi)參基因。EF1-a2是一類真核延伸因子，在蛋白質(zhì)翻譯過程中起著重要作用。在真核生物中參與翻譯調(diào)控、凋亡、細(xì)胞骨架組成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動，編碼的是一種普遍存在且具重要功能的蛋白[37]。在小麥不同器官[38]和蘋果著色期的基因表達(dá)中EF1-a的表達(dá)穩(wěn)定性較好[39]。在對荷花不同發(fā)育時期花瓣中基因表達(dá)情況的研究中，也選擇EF1-a作為內(nèi)參基因[40]。但在刺槐[41]、中國石蒜[30]和珙桐[7]中，EF1-a并不適合作為內(nèi)參基因。RSP3是一類核糖體蛋白，參與蛋白質(zhì)的合成，是真核生物中極為重要的一類蛋白，但該基因用作內(nèi)參基因的研究較少。本研究從甜櫻桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量較高，同時也參與真核生物蛋白質(zhì)的合成，因此將其作為候選內(nèi)參基因，經(jīng)一系列分析，最終表明RSP3基因適合作為甜櫻桃不同發(fā)育時期花芽的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

EF1-a2和RSP3在2個甜櫻桃品種花芽不同發(fā)育階段中均表達(dá)穩(wěn)定，可作為甜櫻桃花芽不同發(fā)育時期的內(nèi)參基因。進(jìn)而可為研究單個品種或多個品種花芽發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況奠定基礎(chǔ)。