李俊維，劉葉，王鈺，郁彭，鄭平，王猛

·生物育種與工藝優(yōu)化·

谷氨酸棒桿菌堿基編輯的條件優(yōu)化

李俊維1,2*，劉葉2,3*，王鈺2,3，郁彭1，鄭平2,3，王猛2,3

1 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457 2 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308 3 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

近年來(lái)，基于CRISPR/Cas9的堿基編輯技術(shù)因其具有不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂、無(wú)需外源DNA模板、不依賴宿主同源重組修復(fù)的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，在動(dòng)物、植物、酵母和細(xì)菌中得到了開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。研究團(tuán)隊(duì)前期已在重要的工業(yè)模式菌株谷氨酸棒桿菌中開(kāi)發(fā)了一種多元自動(dòng)化的堿基編輯技術(shù)MACBETH，為進(jìn)一步優(yōu)化該方法，提高堿基編輯技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用效率，本研究首先在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了基于綠色熒光蛋白 (GFP) 的檢測(cè)系統(tǒng)：將GFP基因的起始密碼子ATG人工突變?yōu)锳CG，GFP無(wú)法正常表達(dá)，當(dāng)該密碼子的C經(jīng)編輯后恢復(fù)為T，即實(shí)現(xiàn)GFP蛋白的復(fù)活，結(jié)合流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，可快速衡量編輯效率。然后，構(gòu)建針對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)的堿基編輯工具，經(jīng)測(cè)試，該位點(diǎn)可成功被編輯，在初始編輯條件下堿基編輯效率為 (13.11±0.21)%。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)初始600、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)編輯條件是：培養(yǎng)基為CGXII，初始600為0.05，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h，IPTG濃度為0.01 mmol/L。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，編輯效率達(dá)到 (30.35±0.75)%，較初始條件提高了1.3倍。最后，選取原編輯條件下編輯效率較低的位點(diǎn)，進(jìn)行了優(yōu)化后編輯條件下的編輯效率評(píng)估，結(jié)果顯示，不同的位點(diǎn)在最優(yōu)編輯條件下的編輯效率提高了1.7–2.5倍，進(jìn)一步證實(shí)該優(yōu)化條件的有效性及通用性。研究結(jié)果為堿基編輯技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中更好的應(yīng)用提供了重要的參考價(jià)值。

堿基編輯，谷氨酸棒桿菌，CRISPR/Cas系統(tǒng)，編輯條件

堿基編輯技術(shù)是近兩年發(fā)展起來(lái)的新型基因組編輯技術(shù)，它結(jié)合了CRISPR/Cas系統(tǒng)的定位功能與堿基脫氨酶的編輯功能，可以實(shí)現(xiàn)在特定位點(diǎn)的堿基替換。相比較于CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因組編輯，堿基編輯技術(shù)不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂 (Double-stranded DNA break，DSB)，不需要外源模板且不依賴于宿主的同源重組修復(fù)，能夠?qū)崿F(xiàn)原核生物多位點(diǎn)編輯，極大地豐富了原核生物的基因組編輯[1]。David Liu研究團(tuán)隊(duì)率先將鼠源胞嘧啶脫氨酶APOBEC1與d/nCas9蛋白進(jìn)行融合，開(kāi)發(fā)了堿基編輯工具BE (Base editor)，實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中胞嘧啶 (Cytosine，C) 到胸腺嘧啶 (Thymine，T) 的單堿基轉(zhuǎn)換[2]；與此同時(shí)，Akihiko Kondo研究團(tuán)隊(duì)則采用七鰓鰻來(lái)源的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1與d/nCas9蛋白進(jìn)行結(jié)合，開(kāi)發(fā)了適用于酵母與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的堿基編輯工具Target-AID (Activation-induced cytidine deaminase)[3]。隨后多個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別在不同的動(dòng)植物和微生物中進(jìn)行了堿基編輯系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化[4-7]。之前的研究工作中，本研究團(tuán)隊(duì)已在重要的工業(yè)模式菌株谷氨酸棒桿菌中首次開(kāi)發(fā)了一種多元自動(dòng)化的堿基編輯方法MACBETH (Multiplex automatedbase editing method)，實(shí)現(xiàn)在.基因組靶標(biāo)位點(diǎn)C到T的轉(zhuǎn)化[8]。MACBETH技術(shù)與谷氨酸棒桿菌中已建立的基于CRISPR/Cas9或Cpf1 的基因組編輯技術(shù)[9-10]相比，具有諸多優(yōu)勢(shì) (表1)，不僅高效、簡(jiǎn)便、易于高通量操作，還可以實(shí)現(xiàn)2個(gè)或3個(gè)靶基因的同時(shí)編輯，同時(shí)，MACBETH技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從質(zhì)粒構(gòu)建、基因組編輯、獲取正確突變株和表型驗(yàn)證的全流程自動(dòng)化操作。

目前，堿基編輯工具的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化僅側(cè)重于基因?qū)用娴母脑靃11-13]，而編輯過(guò)程中的培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)條件、編輯時(shí)間等因素的研究對(duì)于優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)、提高編輯效率同樣至關(guān)重要。因此，為進(jìn)一步提高M(jìn)ACBETH技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的編輯效率，本研究首先在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了基于綠色熒光蛋白 (GFP) 的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)堿基編輯工具編輯，人工沉默的GFP蛋白可以重新被激活，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析表達(dá)GFP蛋白的細(xì)胞的比例，以此快速衡量編輯效率；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基種類、誘導(dǎo)時(shí)初始600、編輯時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到堿基編輯工具最優(yōu)編輯條件；最后，選取基因組中其他位點(diǎn)進(jìn)行編輯，進(jìn)一步對(duì)該最優(yōu)編輯條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒均為筆者實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買和保存，詳見(jiàn)表2。

1.1.2 酶、引物及相關(guān)試劑盒

Q5高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自TaKaRa (大連)；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；多片段同源重組試劑盒購(gòu)自諾唯贊 (南京)；PCR引物 (表3) 由擎科生物 (北京) 有限公司合成；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司。

表1 谷氨酸棒桿菌中CRISPR/Cas編輯技術(shù)與MACBETH技術(shù)的比較

表2 本文所用的質(zhì)粒與菌株

表3 本文使用到的引物

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

LBG培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，葡萄糖5。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

LAS培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，蔗糖150。制備固體培養(yǎng)基時(shí)添加2%的瓊脂。

BHI培養(yǎng)基 (g/L)：BHI 37，(NH4)2SO410，K2HPO40.2，NaH2PO40.3，MgSO4·7H2O終濃度0.5 g/L，pH 7.2。

MgSO4·7H2O為50 g/L的100×儲(chǔ)液，于使用前稀釋加入。

LBHIS 培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨5，氯化鈉10，酵母粉2.5，BHI 18.5，山梨醇91。

CGXII[14]培養(yǎng)基 (g/L)：(NH4)2SO420，尿素5，MOPS 42，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 1.3，上述成分配成水溶液，調(diào)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

MgSO4·7H2O 0.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.001，CuSO40.2 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，上述成分配成100×混合母液，過(guò)濾除菌，于使用前稀釋加入。

CaCl20.01，原兒茶酸0.03，生物素0.2 mg/L，VB1 0.1 mg/L，上述4種成分單獨(dú)配成100×母液，過(guò)濾除菌，于使用前稀釋加入。

葡萄糖5，配成100×母液，115 ℃滅菌15 min，于使用前稀釋加入。

1.2 方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌GFP基因的整合

質(zhì)粒pK18mobsacB-::為模板，利用引物對(duì)GFP-ACG-TGG-F/SacB-R和GFP-ATG-TGG-F/ SacB-R分別擴(kuò)增含M1T、F8W雙位點(diǎn)突變和F8W單位點(diǎn)突變的基因，利用引物對(duì)SacB-F/GFP- ACG-TGG-R和SacB-F/GFP-ATG-TGG-R擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的含蔗糖致死基因的pK18mobsacB質(zhì)粒載體。通過(guò)多片段同源重組獲得pK18mobsacB-off和pK18mobsacB-on質(zhì)粒。

將以上兩質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌13032中，利用蔗糖致死篩選迫使質(zhì)粒上下游同源臂和基因組基因?qū)?yīng)位置發(fā)生雙交換 (圖1A)，從而使off和on基因整合到谷氨酸棒桿菌基因組中。具體雙交換篩選方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

因pK18mobsacB質(zhì)粒無(wú)法在谷氨酸棒桿菌13032中復(fù)制，電轉(zhuǎn)后將復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng)至6 h，提高質(zhì)粒上的同源臂與基因組重組的概率。轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證質(zhì)粒與基因組在上游同源臂處發(fā)生單交換。單交換驗(yàn)證的上游引物在基因組上游同源臂的上游，下游引物在質(zhì)粒下游同源臂的下游。挑取驗(yàn)證正確的單交換菌株至LBG液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。移取100 μL至5 mL LAS液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)16 h，適當(dāng)稀釋后涂布LAS平板，25 ℃培養(yǎng)。挑取LAS平板上的單菌落，分別接種于LBG平板和補(bǔ)充有25 μg/mL Kan抗性的LBG平板。挑選無(wú)法在抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證獲得正確的插入菌株.13032Δ::off和.13032Δ::on。

圖1 谷氨酸棒桿菌GFP熒光檢測(cè)系統(tǒng)示意圖

Fig. 1 Schematic representation of GFP reporter-based detection system in ..

1.2.2 靶標(biāo)GFP基因的堿基編輯工具的構(gòu)建

含GFP gRNA的質(zhì)粒pXMJ19TS-nCas9 (D10A)- AID-gRNA()，下文簡(jiǎn)稱pXMJ19-CAG，具體構(gòu)建方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]，以互補(bǔ)上下游引物形式合成含有GFP gRNA的N20靶標(biāo)序列，通過(guò)95 ℃高溫2 min，并緩慢降至室溫，使上下游引物退火結(jié)合，使用Ⅰ和T4 DNA連接酶將其與pXMJ19TS- nCas9(D10A)-AID-gRNA::質(zhì)粒通過(guò)Golden Gate方法進(jìn)行組裝，構(gòu)建得到該質(zhì)粒。

1.2.3 谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化

取0.5 μg pXMJ19-CAG質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至80 μL.13032Δ:off感受態(tài)細(xì)胞中，具體電轉(zhuǎn)化參數(shù)參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]報(bào)道。轉(zhuǎn)化后細(xì)胞經(jīng)30 ℃后培養(yǎng)1 h后，涂布于含5 μg/mL Cm抗性的LBHIS固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)2–3 d，直至長(zhǎng)出單菌落。

1.2.4 谷氨酸棒桿菌的培養(yǎng)及堿基編輯

1) 種子培養(yǎng)

挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于每孔裝有0.35 mL LBG液體培養(yǎng)基 (含有5 μg/mL Cm) 的96孔深孔板中，30 ℃、800 r/min培養(yǎng)24 h。

2) 誘導(dǎo)培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按初始600為0.2的接種量轉(zhuǎn)接至新的每孔裝有0.35 mL含IPTG (0.05 mmol/L) 及Cm (5 μg/mL) 的LBG液體培養(yǎng)基的96深孔板中，30 ℃、800 r/min培養(yǎng)16 h。單因素條件優(yōu)化后應(yīng)用最優(yōu)條件。誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)流式細(xì)胞儀分析GFP復(fù)活比例。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析GFP蛋白復(fù)活比例

將收集到的菌體，用PBS緩沖液洗2–3次，然后重懸至PBS緩沖液中，并將樣品進(jìn)行稀釋，使得菌體600為0.1左右，為防止菌體黏連，將樣品超聲5 min。采用MoFlo XDP流式細(xì)胞儀 (Beckman Coulter，德國(guó)) 進(jìn)行分析。采用488 nm激發(fā)通道，利用帶通530/40檢測(cè)GFP熒光信號(hào)。檢測(cè)編輯后菌體的熒光強(qiáng)度，記錄有熒光的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，即編輯效率。單個(gè)樣品檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)為100 000個(gè)。

1.2.6 堿基編輯條件的優(yōu)化

種子培養(yǎng)條件同1.2.3部分，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，分別優(yōu)化以下條件。

最優(yōu)培養(yǎng)基的確定：分別測(cè)試LBG、BHI、CGXII、LBHIS四種培養(yǎng)基對(duì)編輯效率的影響。種子培養(yǎng)后以初始6000.2轉(zhuǎn)接至相應(yīng)培養(yǎng)基中，Cm終濃度為5 μg/mL，加入終濃度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。收集菌體，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析編輯比例。

最優(yōu)初始600的確定：種子培養(yǎng)后，分別以初始600為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1轉(zhuǎn)接至最優(yōu)培養(yǎng)基中，Cm終濃度為5 μg/mL，加入終濃度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。收集菌體，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析GFP復(fù)活比例。

最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間的確定：種子培養(yǎng)后，以最優(yōu)初始600轉(zhuǎn)接至最優(yōu)培養(yǎng)基中，Cm終濃度為5 μg/mL，加入終濃度0.05 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min誘導(dǎo)8、12、16、20、24 h。收集菌體，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析GFP復(fù)活比例。

IPTG 最優(yōu)誘導(dǎo)濃度的確定：種子培養(yǎng)后，以最優(yōu)初始600轉(zhuǎn)接至最優(yōu)培養(yǎng)基中，Cm終濃度為5 μg/mL，分別加入終濃度0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG，30 ℃、800 r/min，誘導(dǎo)時(shí)間為最優(yōu)時(shí)間。收集菌體，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析GFP復(fù)活比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷氨酸棒桿菌GFP熒光檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建

為方便谷氨酸棒桿菌中堿基編輯效率的快速測(cè)定與比較，本實(shí)驗(yàn)選擇綠色熒光蛋白 (GFP) 作為報(bào)告蛋白，通過(guò)編輯失活GFP蛋白中的靶標(biāo)位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)GFP蛋白的復(fù)活，結(jié)合流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，快速衡量編輯效率。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)首先突變?cè)蓟?，通過(guò)突變起始密碼子，使得GFP蛋白無(wú)法正常表達(dá)；然后引入F8W突變，人為創(chuàng)造PAM位點(diǎn)，使得ACG中的堿基C位于堿基編輯工具的編輯框內(nèi)，成為靶標(biāo)編輯位點(diǎn)，該基因命名為off。若靶標(biāo)位點(diǎn)C被編輯為T，則恢復(fù)ATG的起始密碼子功能，但F8W突變?nèi)源嬖冢摶蛎麨閛n(圖1B)。將off基因通過(guò)自殺式質(zhì)粒等位基因交換的方法 (圖1A)，整合到谷氨酸棒桿菌13032基因組中，得到.13032Δ::off菌株；作為對(duì)照，同時(shí)將on基因整合至13032基因組中，得到.13032Δ::on菌株。經(jīng)測(cè)試，.13032Δ::off檢測(cè)不到熒光，成功失活GFP蛋白；而.um 13032Δ::on則未受F8W突變點(diǎn)影響，可以檢測(cè)到熒光。該結(jié)果表明若off基因中的靶標(biāo)位點(diǎn)C被成功編輯，則失活GFP蛋白將重新復(fù)活，該檢測(cè)系統(tǒng)可以應(yīng)用于后序的實(shí)驗(yàn)。

2.2 堿基編輯工具復(fù)活GFP熒光蛋白

如圖2A所示，構(gòu)建靶標(biāo)off基因目標(biāo)位點(diǎn)的質(zhì)粒pXMJ19-CAG，該質(zhì)粒包括含Tac誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的nCas9(D10A)-AID融合蛋白表達(dá)框和含組成型啟動(dòng)子P11F的gRNA表達(dá)框，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株.13032Δ::off中，得到重組菌株.13032off/CAG。將重組菌種子培養(yǎng)24 h后，以初始600為0.2轉(zhuǎn)接至新的含5 μg/mL Cm抗性及0.05 mmol/L IPTG的LBG培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)16 h，收集菌體。以菌株13032Δ::on作為陽(yáng)性對(duì)照，13032Δ::off作為陰性對(duì)照 (圖2B)，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析誘導(dǎo)后菌體GFP復(fù)活比例。如圖2C所示，經(jīng)nCas9(D10A)- AID-gRNA堿基編輯系統(tǒng)編輯后，部分.13032off/CAG菌株成功獲得熒光，即off中靶標(biāo)位點(diǎn)ACG成功被編輯為ATG。經(jīng)分析，初始編輯條件下，平均編輯效率為 (13.11±0.21)%。

2.3 堿基編輯條件優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化堿基編輯條件、提高堿基編輯效率，本研究采用上述基于GFP熒光蛋白的檢測(cè)系統(tǒng)，分別對(duì)培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)時(shí)初始600、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.1 培養(yǎng)基類型的優(yōu)化

不同類型的培養(yǎng)基因其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組分不同，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白表達(dá)的影響也不盡相同。分別測(cè)試LBG、BHI、CGXII、LBHIS四種培養(yǎng)基對(duì)編輯效率的影響。結(jié)果如圖3所示：相比于其他3種培養(yǎng)基，CGXII培養(yǎng)基中編輯效率最高，達(dá)到 (17.63±0.25)%。相比其他幾種培養(yǎng)基，CGXII培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，所含無(wú)機(jī)鹽成分復(fù)雜，推測(cè)原因可能為某種無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)于nCas9(D10A)-AID融合蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)機(jī)制有影響，從而導(dǎo)致編輯效果最好。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)初始600的優(yōu)化

在不同初始600的條件下，添加誘導(dǎo)劑會(huì)影響融合蛋白nCas9(D10A)-AID的表達(dá)量，從而影響堿基編輯效率。種子培養(yǎng)后，采用上述最優(yōu)培養(yǎng)基CGXII，分別以初始600為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1轉(zhuǎn)接，經(jīng)誘導(dǎo)后。檢測(cè)編輯效率如圖4所示，當(dāng)初始600在0.01–0.05之間時(shí)，編輯效率隨著初始600增長(zhǎng)而增加；當(dāng)初始600為0.05時(shí)編輯效率最高，達(dá)到(28.28±3.01)%；當(dāng)初始600高于0.05時(shí)編輯效率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，將0.05作為最佳誘導(dǎo)時(shí)初始600。

圖2 pXMJ19-CAG質(zhì)粒示意圖以及流式細(xì)胞儀分析堿基編輯結(jié)果

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)編輯效率的影響

圖4 不同初始OD600對(duì)編輯效率的影響

2.3.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

種子培養(yǎng)后，采用上述最優(yōu)培養(yǎng)基CGXII，并以最優(yōu)初始600為0.05轉(zhuǎn)接，分別于誘導(dǎo)后8、12、16、20、24 h取樣。測(cè)得編輯效率如圖5所示。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，編輯效率不斷提高。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間20 h后編輯效率達(dá)到最大且之后趨于穩(wěn)定，編輯效率為 (29.28±0.27)%。因此，最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間確定為20 h。一般情況下，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短，蛋白表達(dá)量較少，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量提高，導(dǎo)致編輯效率提高，但是誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí) (>20 h)，菌體生長(zhǎng)已處于穩(wěn)定期，菌體不再分裂復(fù)制，蛋白的表達(dá)量也不再提高，所以導(dǎo)致編輯效率趨于平穩(wěn)。

2.3.4 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG會(huì)對(duì)融合蛋白nCas9(D10A)-AID的表達(dá)量產(chǎn)生影響，從而影響編輯效率。分別測(cè)試終濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mmol/L的IPTG對(duì)編輯效率的影響。流式分析編輯效率如圖6所示，當(dāng)IPTG濃度為0.001–0.01 mmol/L時(shí)，編輯效率隨著IPTG濃度的增加而增加，IPTG濃度為0.01 mmol/L編輯效率最高，達(dá) (30.35±0.75)%。當(dāng)IPTG濃度繼續(xù)增大時(shí)，編輯效率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，因此，將0.01 mmol/L作為IPTG的最優(yōu)誘導(dǎo)濃度。

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)編輯效率的影響

圖6 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)編輯效率的影響

2.4 最優(yōu)堿基編輯條件的進(jìn)一步驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述最優(yōu)堿基編輯條件適用于谷氨酸棒桿菌基因組其他位點(diǎn)，選取實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建、含nCas9(D10A)-AID融合蛋白且gRNA靶標(biāo)不同基因 (Cgl0025、Cgl0369、Cgl1314) 的3株菌，分別在初始編輯條件與最優(yōu)編輯條件下對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行編輯。編輯結(jié)束后，兩種不同編輯條件下，每種菌株各挑取10個(gè)單克隆，對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。gRNA序列中任意一個(gè)靶標(biāo)C位點(diǎn)被編輯即視為該單克隆得到編輯，以編輯的單克隆數(shù)所占比例來(lái)衡量編輯效率。如表4所示，通過(guò)比較，3株菌在最優(yōu)堿基編輯條件下的編輯比例提高了1.7–2.5倍，證明了上述優(yōu)化結(jié)果的有效性及通用性。

表4 不同編輯條件下基因組位點(diǎn)編輯比例比較

The underlined Cs in protospacer sequences indicate the target editing sites.

3 討論

堿基編輯技術(shù)由于具有簡(jiǎn)單、高效、高特異性以及低脫靶率等優(yōu)勢(shì)，在原核生物中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。為進(jìn)一步提高谷氨酸棒桿菌中堿基編輯工具的編輯效率，優(yōu)化堿基編輯條件，本研究在谷氨酸棒桿菌中成功構(gòu)建了基于GFP熒光蛋白的快速檢測(cè)系統(tǒng)，并成功編輯靶標(biāo)位點(diǎn)，將失活的GFP蛋白重新復(fù)活，初始編輯條件下編輯效率為 (13.11±0.21)%。通過(guò)單因素條件優(yōu)化，確定了最優(yōu)堿基編輯條件：初始600為0.05，IPTG濃度為0.01 mmol/L，培養(yǎng)基為CGXII，誘導(dǎo)時(shí)間為20 h。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，編輯效率提高到了(30.35±0.75)%，相較于初始條件，提高了約1.3倍。選取原編輯條件下編輯效率較低的位點(diǎn)，進(jìn)行了優(yōu)化后編輯條件下的編輯效率評(píng)估，不同的位點(diǎn)在最優(yōu)編輯條件下的編輯效率提高了1.7–2.5倍，證明了該優(yōu)化結(jié)果的有效性及通用性。該實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)行，為堿基編輯技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中更廣泛高效的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。為進(jìn)一步擴(kuò)展堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用，今后的研究重點(diǎn)將集中于擴(kuò)展靶標(biāo)位點(diǎn)以及降低脫靶效率等方面。

[1] Zhao YW, Jiang WH, Deng ZX, et al. Development and application of base editors in bacterial genome editing. Microbiol China, 2019, 46(2): 319–331 (in Chinese). 趙亞偉, 姜衛(wèi)紅, 鄧子新, 等. 堿基編輯器的開(kāi)發(fā)及其在細(xì)菌基因組編輯中的應(yīng)用. 微生物學(xué)通報(bào), 2019, 46(2): 319–331.

[2] Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420–424.

[3] Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353(6305): aaf8729.

[4] Kim YB, Komor AC, Levy JM, et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nat Biotechnology, 2017, 35(4): 371–376.

[5] Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 441–443.

[6] Zhang YH, Qin W, Lu XC, et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nat Commun, 2017, 8(1): 118.

[7] Zong Y, Wang YP, Li C, et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 438–440.

[8] Wang Y, Liu Y, Liu J, et al. MACBETH: Multiplex automatedbase editing method. Metabol Eng, 2018, 47: 200–210.

[9] Jiang Y, Qian FH, Yang JJ, et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of. Nat Commun, 2017, 8: 15179.

[10] Liu J, Wang Y, Lu YJ, et al. Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for. Microbial Cell Factor, 2017, 16: 205.

[11] Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551(7681): 464–471.

[12] Hu JH, Miller SM, Geurts MH, et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018, 556(7699): 57–63.

[13] Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 2018, 361(6408): 1259–1262.

[14] Keilhauer C, Eggeling L, Sahm H. Isoleucine synthesis inmolecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol, 1993, 175(17): 5595–5603.

[15] Sch?fer A, Tauch A, J?ger W, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from theplasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of. Gene, 1994, 145(1): 69–73.

[16] Ruan YL, Zhu LJ, Li Q. Improving the electro-transformation efficiency ofby weakening its cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity. Biotechnol Lett, 2015, 37(12): 2445–2452.

Optimization of base editing in

Junwei Li1,2*, Ye Liu2,3*, Yu Wang2,3, Peng Yu1, Ping Zheng2,3, and Meng Wang2,3

1 School of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China 2 Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

In recent years, CRISPR/Cas9-mediated base editing has been developed to a powerful genome editing tool, providing advantages such as without introducing double-stranded DNA break, a donor template and relying on host homologous recombination repair pathway, and has been widely applied in animals, plants, yeast and bacteria. In previous study, our group developed a multiplex automated base editing method (MACBETH) in the important industrial model strain. In this study, to further optimize the method and improve the base editing efficiency in., we first constructed a green fluorescent protein (GFP) reporter-based detection system. The point mutation in the inactivated GFP protein can be edited to restore the GFP fluorescence. By combining with flow cytometry analysis, the base-editing efficiency can be quickly calculated. Then, the base editor with the target gRNA was constructed, and the editing efficiency with the initial editing condition was (13.11±0.21)%. Based on this result, the editing conditions were optimized and the result indicated that the best medium is CGXII, the best initial600of induction is 0.05, the best induction time is 20 h, and the best IPTG concentration is 0.01 mmol/L. After optimization, the editing efficiency was improved to (30.35±0.75)%, which was 1.3-fold of that in initial condition. Finally, endogenous genomic loci of.were selected to assess if the optimized condition can improve genome editing in other loci. Editing efficiency of different loci in optimized condition were improved to 1.7–2.5 fold of that in original condition, indicating the effectiveness and versatility of the optimized condition. Our research will promote the better application of base editing technology in..

base editing,, CRISPR/Cas system, editing condition

李俊維, 劉葉, 王鈺, 等. 谷氨酸棒桿菌堿基編輯的條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 143–151.

Li JW, Liu Y, Wang Y,et al. Optimization of base editing in. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 143–151.

May 14, 2019;

August 13, 2019

Supported by:Key Project of Chinese Academy of Sciences (No. QYZDB-SSW-SMC012), Biological Resources Programme of Chinese Academy of Sciences (No. KFJ-BRP-009), Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. KFZD-SW-215),International Partnership Program of Chinese Academy of Sciences (No. 153D31KYSB20170121), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31700044, 31870044).

Meng Wang. Tel: +86-22-24828791; E-mail: wangmeng@tib.cas.cn

*These authors contributed equally to this study.

10.13345/j.cjb.190192

中國(guó)科學(xué)院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目 (No. QYZDB-SSW-SMC012)，中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源計(jì)劃 (No. KFJ-BRP-009)，中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. KFZD-SW-215)，中國(guó)科學(xué)院國(guó)際合作局對(duì)外合作重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 153D31KYSB20170121)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31700044, 31870044) 資助。

2019-09-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190909.1005.004.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)